JoVE 실험 백과사전
암 연구
0 조회수 • 4:59 분 • April 30th, 2023
- 레트로바이러스는 역전사효소를 사용하여 RNA 게놈을 이중 가닥 DNA로 변환하고 숙주 게놈에 영구적으로 통합함으로써 복제되는 RNA 바이러스입니다. 새로운 바이러스 입자가 세포를 빠져나와 다른 세포를 감염시킬 수 있습니다. 암 유전자 치료는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 형질도입(transduction)이라는 기술을 통해 치료 유전자를 표적 세포에 도입하여 돌연변이된 유전자를 하향 조절하거나 세포를 제거합니다.
high-titer 레트로바이러스 벡터를 얻으려면 원하는 레트로바이러스 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 적절한 transfecting agent를 포함하는 transfection 혼합물로 HEK 293 세포를 transfection합니다. 세포를 배양합니다. transfecting agent는 두 plasmids가 세포로 전달되는 것을 용이하게 합니다.
레트로바이러스 플라스미드는 바이러스 게놈을 표적 유전자와 함께 암호화하고, 패키징 플라스미드는 바이러스 외피 단백질을 암호화합니다. 패키징 세포의 세포 기계는 레트로바이러스 입자를 형성하여 배지로 방출합니다. 바이러스 상층액과 원심분리기를 모아 세포를 제거합니다.
원하는 농도의 바이러스 입자와 암세포를 피브로넥틴으로 코팅된 배양판으로 전달하여 바이러스 외피 단백질이 세포에 쉽게 결합할 수 있도록 합니다. 세포를 배양합니다. 세포를 수집하고 유세포 분석을 수행하여 transduction efficiency를 분석합니다. 이 프로토콜은 c-Kit 양성 마우스 골수 세포의 레트로바이러스 매개 형질주입을 수행합니다.
- 먼저 레트로바이러스 플라스미드 DNA를 1.5ml 튜브에 포장 플라스미드, 염화칼슘 및 물과 결합합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 HBS를 다른 1.5밀리리터 튜브에 추가합니다. HBS가 포함된 튜브에 transfection 혼합물을 적가형으로 첨가하는 동시에 가장 낮은 설정으로 설정된 vortexer와 혼합합니다.
형질주입 혼합물을 실온에서 20-30분 동안 배양합니다. 잠복기 동안 HEK 세포에 클로로퀸을 첨가하고 인큐베이터에 보관합니다. transfection mix를 첨가한 후 섭씨 37도의 5% CO2 배양기에서 8시간 동안 세포를 배양하고 14ml의 새로운 DMEM 10 배지를 매우 천천히 첨가하여 세포 배지를 변경합니다. 접시 벽에 천천히 피펫을 대면 HEK 세포가 벗겨지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
그런 다음 섭씨
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요