0 조회수 • 4:59 분 • April 30th, 2023
- 레트로바이러스는 역전사효소를 사용하여 RNA 게놈을 이중 가닥 DNA로 변환하고 숙주 게놈에 영구적으로 통합함으로써 복제되는 RNA 바이러스입니다. 새로운 바이러스 입자가 세포를 빠져나와 다른 세포를 감염시킬 수 있습니다. 암 유전자 치료는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 형질도입(transduction)이라는 기술을 통해 치료 유전자를 표적 세포에 도입하여 돌연변이된 유전자를 하향 조절하거나 세포를 제거합니다.
high-titer 레트로바이러스 벡터를 얻으려면 원하는 레트로바이러스 플라스미드, 패키징 플라스미드 및 적절한 transfecting agent를 포함하는 transfection 혼합물로 HEK 293 세포를 transfection합니다. 세포를 배양합니다. transfecting agent는 두 plasmids가 세포로 전달되는 것을 용이하게 합니다.
레트로바이러스 플라스미드는 바이러스 게놈을 표적 유전자와 함께 암호화하고, 패키징 플라스미드는 바이러스 외피 단백질을 암호화합니다. 패키징 세포의 세포 기계는 레트로바이러스 입자를 형성하여 배지로 방출합니다. 바이러스 상층액과 원심분리기를 모아 세포를 제거합니다.
원하는 농도의 바이러스 입자와 암세포를 피브로넥틴으로 코팅된 배양판으로 전달하여 바이러스 외피 단백질이 세포에 쉽게 결합할 수 있도록 합니다. 세포를 배양합니다. 세포를 수집하고 유세포 분석을 수행하여 transduction efficiency를 분석합니다. 이 프로토콜은 c-Kit 양성 마우스 골수 세포의 레트로바이러스 매개 형질주입을 수행합니다.
- 먼저 레트로바이러스 플라스미드 DNA를 1.5ml 튜브에 포장 플라스미드, 염화칼슘 및 물과 결합합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 HBS를 다른 1.5밀리리터 튜브에 추가합니다. HBS가 포함된 튜브에 transfection 혼합물을 적가형으로 첨가하는 동시에 가장 낮은 설정으로 설정된 vortexer와 혼합합니다.
형질주입 혼합물을 실온에서 20-30분 동안 배양합니다. 잠복기 동안 HEK 세포에 클로로퀸을 첨가하고 인큐베이터에 보관합니다. transfection mix를 첨가한 후 섭씨 37도의 5% CO2 배양기에서 8시간 동안 세포를 배양하고 14ml의 새로운 DMEM 10 배지를 매우 천천히 첨가하여 세포 배지를 변경합니다. 접시 벽에 천천히 피펫을 대면 HEK 세포가 벗겨지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
그런 다음 섭씨 37도, 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 10ml 주사기를 사용하여 바이러스 상층액을 수집합니다. 그런 다음 0.45마이크로미터 주사기 필터를 주사기에 부착합니다. 바이러스 상층액을 새 수집 튜브에 넣습니다. 약 16시간 후에 바이러스 상층액을 수집합니다.
그런 다음 PBS의 재조합 인간 피브로넥틴 단편 2ml를 처리되지 않은 6웰 배양 플레이트에 추가합니다. 다음 날, 피펫을 사용하여 플레이트에서 피브로넥틴을 제거합니다. PBS에서 2% BSA로 플레이트를 차단하고 실온에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
진공 청소기를 사용하여 BSA를 제거하고 진공 청소기로 제거하기 전에 PBS로 플레이트를 세척하십시오. 그 후, 즉시 여과된 바이러스 상등액을 첨가하고 플레이트를 2시간 동안 원심분리합니다. 진공 청소기를 사용하여 상등액을 제거하고 플레이트를 다시 회전시킵니다.
다음으로, 진공 청소기로 상층액을 제거하고 바이러스가 코팅된 웰을 PBS로 세척합니다. 진공 청소기로 PBS를 제거합니다. 이전에 배양한 c-Kit+ 마우스 세포를 바이러스로 코팅된 웰에 추가합니다. 원심분리 후 섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 세포를 배양합니다. 형질도입 48시간 후, 원심분리를 통해 세포를 펠렛화하고 FACS 완충액 번호 1에 재현탁합니다.