세포외 퓨린 대사: 백혈병 세포의 아데노신 생성 및 대사를 측정하기 위한 HPLC 기반 분석

- 세포 외 공간에 공칭 농도로 존재하는 퓨린 뉴클레오시드인 아데노신은 생리학적 조건에서 세포 증식을 확인하는 데 도움이 됩니다. 백혈병과 같은 병리학적 상태에서는 세포 외 아데노신 농도가 증가하여 암세포에 대한 면역 반응을 억제합니다. 아데노신 축적은 ATP 또는 ADP 뉴클레오티드 탈인산화로 인해 발생하거나 아데노신에서 이노신 뉴클레오시드로의 분해 손상으로 인해 발생합니다.

아데노신 생성 및 소비를 측정하려면 뉴클레오티드 기질이 있는 곳에서 암세포를 배양합니다. 세포의 아데노신 대사 활성은 배양물 내에 존재하는 다양한 퓨린 분자의 농도를 결정합니다. 세포를 제거하고 상층액에서 퓨린 분자를 얻기 위한 원심분리기.

퓨린을 분리하고 정량화하려면 샘플을 적절한 바이알로 옮기십시오. 소수성 리간드로 고정되지 않은 고정상을 포함하는 역상, 고성능 액체 크로마토그래피 또는 RP-HPLC 컬럼에 로드합니다. 컬럼을 통과하는 동안 소수성 분자는 리간드에 흡착되고 소수성에 따라 유지됩니다. 소수성이 가장 적은 분자가 먼저 흘러나오고, 소수성이 가장 높은 분석물이 마지막에 용리됩니다.

HPLC 크로마토그램에서 각 분석물질의 피크 특성을 연구하면 시료 내 농도를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜에서는 RP-HPLC 기술을 사용하여 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 외 퓨린 대사를 정량화합니다.

- AMP 소비와 아데노신 및 이노신 생성을 테스트하기 위해 250마이크로리터의 무혈청 배지에 200만 개의 CD19 양성, CD5 양성 CLL 세포를 재현탁하고 48웰 플레이트에 세포를 플레이트화합니다. 250마이크로리터의 400마이크로몰 AMP 또는 AMP 플러스 억제제를 추가하여 200마이크로몰 AMP의 최종 농도를 얻습니다. 빈 샘플로 사용할 기질이 없는 조건을 포함합니다.

섭씨 37도에서 30분에서 60분 동안 배양합니다. 배양 시간이 끝나면 차가운 마이크로 원심분리 튜브에 500마이크로리터의 상등액을 수집합니다. 즉시 섭씨 4도에서 17,000배 G로 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 HPLC 실행을 위한 시료 전처리를 진행하거나 즉시 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 억제제로 전처리하고 AMP 기질로 배양한 후 0.2미크론 주사기 필터로 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 상층액을 여과합니다. 필터링을 위해 1밀리리터 주사기를 사용하십시오.

HPLC 시스템에