Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

이 영상은 수정 후 1~3일 된 제브라피시 배아의 망막 및 망막 색소 상피(RPE)가 부착된 망막의 미세 절제 과정을 보여줍니다. 모든 과정은 미세 핀셋과 일반 실험실 소모품을 사용하여 수행할 수 있습니다. 망막 절제를 위한 표준 실체 현미경 하에서, 단층 구조인 RPE를 브러싱 동작과 배양 플레이트 표면에 대한 RPE의 부착력을 이용하여 제거하고 벗겨냅니다.

RPE 부착 망막 박리를 위해, 박리 전 배양 플레이트의 접착 특성을 배아 압착과 세척을 통해 제거합니다. RPE를 온전하게 보존하기 위해 이 조직을 조심스럽게 들어 올려 맥락막과 공막을 RPE 부착 망막으로부터 효율적으로 분리한 다음, 화학적으로 식각된 텅스텐 바늘을 사용하여 수정체를 제거합니다. 이 박리 방법은 온전한 망막 조직을 얻을 수 있어 조직 특이적 RNA 발현, 제브라피쉬 망막 및 망막 색소 상피의 프로파일 연구에 성공적으로 활용되었습니다.

안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 생물과학과의 UFE Leon 교수 연구실 소속 Li Jang입니다. 오늘은 제브라피쉬 배아의 안구 조직을 해부하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 안구 발달을 조절하는 유전자 네트워크를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. 여덟 번째로, 미세 절단 전에 다음 용액들을 준비하십시오. E3 배지, 여과 멸균된 링거 용액, 그리고 5 N 수산화나트륨입니다.

다음으로, 텅스텐 바늘을 화학적으로 에칭합니다. 비커를 다루기 쉽게 하고 수산화나트륨이 쏟아지는 것을 방지하기 위해, 찰흙을 이용하여 페트리 접시 안에 작은 비커를 고정합니다. 비커 측면에 표준 종이 클립을 부착합니다.

클립이 수산화나트륨에 닿을 때까지 비커에 일반 수산화나트륨 5를 붓습니다. DC 전원 공급 장치의 음극을 종이 클립에 연결하고, 양극을 짧은 텅스텐 와이어의 한쪽 끝에 연결합니다. 텅스텐 와이어의 반대쪽 끝을 직경 4mm의 점토 공으로 감싼 후, 이 끝을 수산화나트륨 용액에 담급니다.

전압을 약 3V까지 높이고, 수산화나트륨 용액에 와이어를 1초 간격으로 위아래로 담그는 과정을 약 10분 동안 반복합니다. 수산화나트륨에 노출된 텅스텐 와이어는 점차 가늘어지며, 양극에 연결된 와이어의 반대편에서 점토 공이 떨어져 나가면 끝부분이 날카로운 바늘 모양이 됩니다. 링거 용액(ringer solution) 또는 E3 용액으로 날카로운 바늘을 헹구어 염분 침전물을 제거한 후, 배아 해부를 위해 다루기 쉽도록 테이프나 니들 홀더를 사용하여 나무 어플리케이터에 바늘을 부착합니다.

번식 전날 밤, 표준 프로토콜에 따라 성체 super fish를 유지 관리합니다. 정적인 번식 탱크에서 격벽을 사용하여 어버이 물고기를 쌍별로 분리합니다. 다음 날 아침 실내 조명을 켠 후 격벽을 제거하고, 30분 간격으로 10분 동안 어버이 물고기가 교배하도록 하며, 매 교배 후에는 물고기를 다시 분리합니다.

각 교배에서 수집한 배아를 E three 배지에서 28 °C로 각각 배양하십시오. 수정 후 10~12시간에 배아의 단계를 확인하고, 특정 시점의 해부 직전에 다시 단계를 확인하십시오. 해부 시에는 Falcon 60 x 15 mm 폴리스티렌 배양 플레이트를 사용하십시오.

새로운 미사용 플레이트는 약 20분 동안 RPE 조직에 대해 고유한 접착 특성을 가지며, 이는 망막 박리 시 RPE 제거에 도움이 될 수 있습니다. RPE가 부착된 망막이 필요한 경우, 링거액이 담긴 배양 플레이트에서 배아 두 개를 완전히 으깬 후 박리 전 30분 동안 방치하고, 이어서 신선한 링거액으로 충분히 세척함으로써 이러한 접착 특성을 극복할 수 있습니다. 모든 미세 박리는 Olympus SC X 16 현미경의 1x 대물렌즈를 사용하여 약 5~8배 배율에서 수행합니다.

Dumont 핀셋이나 화학적으로 식각된 텅스텐 바늘을 사용하여, 현미경 스테이지를 28 °C로 가온합니다. 망막 박리를 시작할 때 온도 변화의 영향을 최소화하기 위해, 특정 발달 단계의 배아를 RRPE 없는 망막 박리법으로 준비된 Falcon 60 by 15 millimeter 배양 플레이트 내 5 mL의 Ringer 용액으로 옮깁니다. 핀셋의 날카로운 끝을 사용하여 머리와 전방 몸통 일부를 빠르게 절단하여 제브라피쉬의 몸통을 제거합니다. 다음으로, 머리와 몸통 절편의 후단을 배양 플레이트에 고정합니다. 보조 핀셋을 사용하여 전두부부터 시작하여 머리의 등쪽을 엽니다.

안구의 내측면이 노출되어 이후 조작을 위해 위를 향하도록 뇌를 제거합니다. 망막을 박리하기 위해, 핀셋 끝을 사용하여 위를 향한 안구 내측면의 노출된 RPE를 망막으로 연결되는 작은 틈이 보일 때까지 조심스럽게 쓸어냅니다. 망막의 내측면이 거의 모두 노출될 때까지 쓸어내어 벗겨내는 동작을 계속합니다.

배양 접시를 향하고 있는 안구의 망막에서 외측 RPE를 제거할 때, 노출된 망막에 긁힘이나 구멍이 생기지 않도록 주의하십시오. 배양 플레이트 표면으로부터 약 45도 각도를 유지하며 핀셋으로 안구를 가볍게 쓸어내십시오. 분리된 RPE 부분을 배양 플레이트에 고정하여 해부함으로써, 전거톱니모양체(ora serrata)에 비교적 단단하게 부착된 RPE를 제거하십시오.

그다음 망막을 조심스럽게 들어 올려 잔류 RPE를 세척하고, 배양 접시의 접착 특성을 이용하여 수정체를 제거합니다. 이때 접시 표면에 가볍게 부착될 망막 세포가 손상되지 않도록 주의하십시오. 굴리기 기법으로 수정체가 분리되지 않을 경우, 에칭된 텅스텐 바늘을 사용하여 수정체 표면을 원형으로 휘저어 분리하십시오.

RPE 부착 망막 박리를 시작하려면, RPE 부착 망막 박리용으로 준비된 Falcon 60 by 15 millimeter 배양 플레이트를 사용하십시오. 특정 발달 단계의 배아를 5 mL의 링거액으로 옮깁니다. 머리와 전신 몸통 일부를 절단합니다.

이전에 수행한 것과 같이 제브라피시의 몸통을 빠르게 제거합니다. 배양 플레이트 위에 머리 몸통 섹션의 후단을 고정합니다. 보조 핀셋을 사용하여 전두부부터 시작하여 등쪽 방향으로 머리를 엽니다.

안구의 내측면이 위를 향하도록 노출시킨 후 뇌를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 추가 조작을 수행할 때는 안구의 후외측을 부드럽게 들어 올려 전측으로 굴립니다. RPE 층 바깥쪽의 맥락막과 공막 조직은 피부에 비교적 단단히 부착되어 있으며, 안구를 전측으로 조심스럽게 굴려 대부분 벗겨낼 수 있습니다.

망막 박리를 위해 눈의 측면이 노출되고 눈이 여전히 피부에 부착되어 있는 상태에서 텅스텐 바늘을 사용하여 수정체를 제거합니다. RPE와 RPE가 부착된 망막이 없는 상태에서, 박리된 샘플을 이후의 RNA 특성 분석을 위해 RNA re 마이크로 튜브의 triol에 수집할 수 있습니다.

RPE가 제거된 성공적인 망막 박리 결과가 여기에 제시되어 있으며, 손상되지 않은 망막 표면에서 알 수 있듯이 망막의 무결성이 유지되었습니다. 해당 조직 절편 또한 망막 구조가 매우 잘 유지되고 있음을 보여줍니다. 특히, 광수용체 층과 RPE 사이의 세포외 기질 보존 상태가 매우 뛰어납니다.

성공적으로 RPE가 부착된 망막 박리는 손상 없이 연속적인 RPE 층으로 확인됩니다. 해당 조직 절편을 통해 망막 세포와 RPE 세포 모두 양호한 상태임을 알 수 있습니다. 박리된 망막에서 추출한 총 RNA는 높은 품질을 유지합니다.

이는 바이오애널라이저(bioanalyzer) 분석을 통해 얻은 전기영동도와 겔 이미지로 확인할 수 있습니다. 기저선은 평탄하며 18 s 및 28 s 리보솜 피크가 온전하게 나타납니다. RNA 무결성 지수(RNA integrity number)는 일반적으로 9.8보다 큽니다.

지금까지 RPE(망막색소상피)가 포함된 경우와 포함되지 않은 경우의 제브라피쉬 배아 망막을 얻기 위한 미세 해부 절차를 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 망막 해부에서 가장 중요한 단계는 포셉 끝을 이용한 브러싱 동작과 조직 롤링임을 기억하는 것이 중요합니다. RPE 잔해를 제거할 때, 해부하는 동안 의자의 조절 가능한 팔걸이에 팔꿈치를 올리면 손의 움직임을 상당히 안정시킬 수 있음을 확인했습니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.