Name: Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-27T23:34:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 배우세요 제브라피시 배아 눈 조직의 미세절단 기법을 통해 망막과 망막색소상피를 분리하는 방법을 Danio rerio에서. 이 기술은 조직 특이적 RNA 발현 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 퍼듀 대학에서 생물학의학과에서 시작 기금에 의해 지원됩니다.

1 부 : microdissection 전 준비 <ol><li> 솔루션 <ol class="lalpha"><li> E3 매체 4 (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2, 0.33 MM MgSO 4). </li><li> 링어의 솔루션 1, 5 (116 MM NaCl, 2.9 KCl MM 1.8 MM CaCl 2, 5 MM HEPES, pH7.2), 필터 살균. </li><li> 5N NaOH. </li></ol></li><li> 텅스텐 바늘의 화학 에칭 <ol class="lalpha"><li> 점토하여 페트리 접시에 5N NaOH를 포함하는 작은 비커를 확보. </li><li> 그것은 NaOH 용액과 접촉할 수 있도록 비커의 측면에 종이 클립을 부착합니다. </li><li> 종이 클립과 텅스텐 와이어의 짧은 조각 (~ 2cm)의 권력을 긍정적인 전극에 DC 전원 공급 장치의 음극을 연결합니다. </li><li> 작은 점토 공과 텅스텐 와이어의 다른 쪽 끝을 싸서 NaOH 용액에이 끝부분을 찍어. </li><li> 약 3V로 전압을 증가시키고 좋은 에칭 속도가 접수 때까지 NaOH 용액에 철사를 찍어 내려. 좋은 품질의 바늘은 보통 10 분 이내에 에칭 수 있습니다. </li><li> 솔루션에 노출 텅스텐 와이어 점차 얇은 될 것입니다. 흙 공이 꺼져 방울 때, 여전히 긍정적인 전극에 연결된 전선의 다른 한쪽은 날카로운 바늘 모양을 것입니다. </li><li> 소금 예금을 제거하는 링어의 솔루션 또는 E3와 날카로운 바늘을 씻어. </li><li> 테이프로 나무 작은 주걱이나 쉽게 처리할 수있는 바늘 홀더에 바늘을 연결합니다. </li></ol></li><li> 문화 플레이트 <ol class="lalpha"><li> 팰컨 60 X 15mm의 폴리스티렌 문화 번호판은 망막 microdissection에 사용할 준비가 된 것입니다. </li><li> RPE 연결된 망막을 해부를위한 30 분 해부하기 전에 표면의 접착력을 없애 링어의 솔루션을 포함하는 문화 판에서 완전히이 배아를 부술. 곧 절개 전에 신선한 링어의 솔루션을 광범위하게 접시를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 배아의 수집 및 준비 <ol class="lalpha"><li> 성인 zebrafish 4, 5 설명된대로 유지됩니다. </li><li> 구분선에 의해 번식 전에 밤에 pairwise 정적 사육 탱크에있는 부모 물고기를 분리합니다. </li><li> 객실 표시등이 다음날 아침에 켜져 후 분할기를 제거합니다. 부모가 매 30 10 분 간격으로 시간을 통과하도록 허용합니다. 각 교차로 후 생선을 분리. </li><li> 28 별도로 E3 매체의 각 교차로에서 수집한 배아를 유지 ° C. </li><li> 설립 기준 1, 6에 따라 10~12시간 포스트 수정 (HPF)와 restage 즉시 특정 시간 지점에서 해부하기 전 무대 배아. </li></ol></li></ol> 2 부 : 해부 - 뇌의 제거 및 안구 노출 1 <ul><li> 이 절에서 설명하는 절차는 망막 (부품 3A)와 RPE 연결된 망막 (파트 3B) 해부 일반적인 수 있습니다. </li><li> 모든 미세 해부는 더몬트 집게의 끝부분에 의해 행해지며 조직을 위치에 대한 더몬트 포셉 또 한 쌍의에 의해 지원됩니다. 화학적 - 새겨져 텅스텐 바늘은 미세한 조작 필요한 경우 사용할 수 있습니다. </li><li> 모든 미세 해부는 1X 목적 또는 동급을 갖춘 올림푸스 SZX16 현미경 ~ 5 배속 배율에서 수행됩니다. </li><li> 28 벤치 최고 인큐베이터에서 E3 중간에 배아를 유지 ° C 해부하는 동안 쉽게 배아 액세스에 대한 현미경 옆에. </li><li> 현미경 단계는 유전자 발현에 대한 온도 변동의 영향을 최소화하기 위해 온도 플레이트에 의해 28 ° C로 예열합니다. </li></ul><ol><li> 제 1 부 # 3에서 설명한대로 팰컨 60 X 15mm 문화 플레이트에 링어의 솔루션에 대한 특정 발달 단계에서 배아를 전송 준비. </li><li> 시체에서 빠르게 앞쪽에 트렁크의 일부로 머리를 잘라. </li><li> 지원 포셉과 문화 판에서이 조직의 뒷부분 끝을 핀. </li><li> 앞쪽에 이마에서 시작 등의 측면에 머리를 엽니다. </li><li> 눈의 중간 측면이 노출되고 더 조작에 대한 상향 직면되도록 머리를 제거합니다. </li></ol> 부품 3A : 망막 절개 1 <ol><li> 로 제 2에 설명되어있는 배아를 준비합니다. </li><li> 조심스럽게 망막에있는 작은 오프닝을 볼 때까지 포셉의 일각에 의해 위쪽으로 직면하고있는 안구 공의 중간 측면에 노출된 RPE를 브러시. </li><li> 빗질과 망막의 중간 측면은 거의 모든 노출 때까지 작업을 필링을 계속합니다. 긁힘 및 노출된 망막을 펀칭을 피한다. </li><li> 이제 아래 직면하고있는 망막, 접근의 측면 RPE를 제거하려면 해당과 문화 플레이트 표면에서 약 45 °의 각도로 칫솔. </li><li> C로 RPE의 분리 부분을 달아하여 오라 세라타 상대적으로 단단히 연결되어 RPE를 제거다음 ulture의 해부에 대한 판하고 망막을 부드럽게 리프트. </li><li> 잔류 RPE를 정리하기 위해 문화 접시의 바닥에있는 망막을 롤. <ol class="lalpha"><li> 우리는 배아가 깔린되면이 특정 팰컨 폴리스티렌 문화 플레이트가 약 20 분 RPE의 우선 준수를 가지고 것으로 나타났습니다. 이 속성은 RPE 잔존물의 제거를 위해 활용됩니다. 그러나, 망막 세포는 높은 배율에 따라 밀접하게 검사 수있는 낮은 정도로 표면에 막대기를 않습니다. 하나는 RPE 제거 및 망막 무결성의 완성도간에 균형을 공격한다. </li><li> 렌즈는 종종 문화 판을 준수하고 압연 과정에서 망막에서 분리합니다. 때때로, 그것은 렌즈 표면에 소용돌이 치는 동작과 함께 새겨져 텅스텐 바늘에 의해 렌즈를 분리하는 것이 필요합니다. </li></ol></li><li> 이러한 절차를 성공적으로 조직의 무결성을 손상시키지 않고 망막의 RPE를 제거할 수 있습니다. 이것은 좋은 전반적인 형태 (그림 1B와 B ') 및 조직학 (그림 1B ")로 표시되는 화살표 특히, photoreceptor 레이어와 RPE 사이에있는 세포외 기질의 보존 (그림 1B 매우 좋습니다."; 전체 배아 (그림 1A "))에서 조직학 비교. </li></ol> 부품 3B : RPE 연결된 망막 절개 3 <ol><li> 로 제 2에 설명되어있는 배아를 준비합니다. </li><li> 보조 포셉하여 문화 판에 머리를 핀. 뒷부분 측면 측면에서 부드럽게 눈을 들어 앞쪽에쪽으로 롤. <ol class="lalpha"><li> RPE 계층의 외부에 추정 맥락막과 scleral 조직은 피부에 상대적으로 긴밀하게 연결되어 있으며, 주로 앞쪽에쪽으로 조심스럽게 눈을 압연에 의해 해제 벗겨 수 있습니다. </li></ol></li><li> 눈 측면 측면이 노출되고 안구가 계속 피부에 신경을 쓰는 경우 후 텅스텐 바늘로 렌즈를 제거합니다. </li><li> 이러한 절차를 성공적으로 망막을 가지고있는 전체의 RPE 계층을 보존할 수 있습니다. 추정 choroids과 scleral 조직은 크게 (그림 1C, C '와 C') 제거할 수 있습니다. </li></ol> 4 부 : RNA 작업에 조직 샘플 컬렉션 <ol><li> 해부 표본으로 1 일 이전에 설명한 스트림 RNA 특성화를위한 RNase 무료 microfuge 튜브에 TRIzol 수집하실 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2028/2028fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. (A) 래터럴과 절개 전 52 HPF에서 zebrafish 애벌레 머리 (A ') 등의 볼 수 있습니다. (A) &amp; (A '). (B) 래터럴과 (B'54 HPF에서 해부 망막의) 지느러미 참조하십시오. 망막의 표면 측면 모두에서 손상되지 않았어요에서 애벌레 머리 ( ") 해당 histological 섹션 그리고 지느러미 전망. (B) &amp; (B ')에서 해부하는 망막의 (B ") 해당 histological 섹션을 참조하십시오. 망막과 망막 라미네이션의 구조는 손상되었다. 특히, photoreceptor 계층 및 RPE (A 사이의 세포외 기질은 "(화살표, 화살표) 잘 해부 망막 B)에 보존되었다." (C) 래터럴 52 HPF에서 해부 RPE 연결된 망막의 (C ') 중간 볼 수 있습니다. RPE 계층도를 해부 조직의 histological 섹션 (C ')로 표시되었던, 손상 및 지속되었다. C'의 하얀 부분은 시신경 (화살표)입니다. 조직학 들어, 조직 샘플은 4 %의 수집 및 고정되었습니다 3 설명된대로 paraformaldehyde. 삽입 이러한 샘플 sectioning 플라스틱이 수행되었다. 스케일 막대 = 50 μm의이.

<ol><li>Leung, Y. F., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina.</a> Zebrafish. 2, 269-283 (2005).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factorial+microarray+analysis+of+zebrafish+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).</li>
<li>Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+zebrafish+embryonic+retinal+pigment+epithelium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).</li>
<li>Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish : a practical approach. , 1st ed, Oxford University Press. Oxford ; New York. (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+book+%3A+a+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Fadool, J. M., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+eye+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of eye genetics.</a> Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).</li>
</ol>

동물 실험은 퍼듀 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

zebrafish 아이 조직의 Microdissection 효과적으로 그대로 망막 및 RPE 연결된 망막을 얻을 수 있습니다. 이것은 실질적으로 특정 안구 조직 (예 : 망막 또는 RPE)에 관한 표현 연구를 지원합니다. 사실, 우리는 성공적으로 전체 망막 1 RPE 3 RNA 발현 프로파일을 얻기 위해이 절차를 이용합니다. 해당 프로필의 유틸리티는 강력 망막 차별 돌연변이에 불안정하게된다 는걸 알수 경로와 유전자 가족의 최근 식별에 의해 지원됩니다. 망막 절개 절차에서 가장 중요한 단계는 RPE 잔존물 제거를위한 압연 포셉 및 조직의 끝으로 빗질 조치하고 있습니다. 우리는 해부 동안 의자에 달려 조정 팔을 팔꿈치를 퍼팅 찾기 실질적으로 원치 않는 손 움직임을 안정 수 있습니다. 또한, 일부 RPE 잔존물은 오라 세라타에 남아있을 수 있습니다. 이 지역은 해부를위한 문화 판의 준수 표면과 접촉 올 수 있기 때문입니다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 RPE 세포는 닦고 및...

<table><tbody><tr><td>무선 유발 모터</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치</td><td>라스카(Lascar)</td><td>PSU130</td><td>어떤 DC 전원 공급 장치든 사용 가능합니다. 다른 장비를 사용할 경우, 해당 장비의 특정 전압에 대한 추가적인 최적화가 필요합니다.</td></tr><tr><td>일회용 유발봉 &amp;마이크로튜브, 1.5 mL (DNase, RNase 및 파이로젠 프리)</td><td>VWR international</td><td>47747-366</td><td>이것들은 발현 분석을 위한 TRIzol 내 조직 수집에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Dumont #5 핀셋, 팁: 0.05 x 0.01mm, Inox</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500341</td><td>미세한 팁 치수가 바람직하지만, 때때로 팁을 날카롭게 다듬어야 할 수도 있으므로 반드시 고정되어야 하는 것은 아닙니다.</td></tr><tr><td>Dumont #5SF 핀셋, 팁: 0.025 x 0.005mm, Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>미세한 팁 크기가 바람직하지만, 때때로 팁을 더 날카롭게 갈아내야 할 수도 있으므로 반드시 이 치수를 엄격하게 고수할 필요는 없습니다.</td></tr><tr><td>Falcon 폴리스티렌 배양 플레이트, 60 X 15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td>이 플레이트들은 해부용 플레이트로 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Olympus SZX16 실체현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX16</td><td>어떤 실체 현미경이든 사용 가능합니다. 이전 연구에서는 Leica 실체 현미경을 사용하였습니다.&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; 문제없이 진행되었습니다. 또한 2배율 대물렌즈가 설치되어 있음에도 불구하고, 해부 과정에는 1배율 대물렌즈만을 전적으로 사용하였습니다. </td></tr><tr><td>숫돌</td><td>Fine Science Tools</td><td>29008-01</td><td>필요한 경우, 이를 사용하여 핀셋의 끝을 날카롭게 다듬으십시오.</td></tr><tr><td>가열 플레이트</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U55SZX2B</td><td>이는 해부 과정 전반에 걸쳐 조직의 온도를 유지하고, 온도 변화가 유전자 발현에 미치는 영향을 최소화하기 위해 사용됩니다. 또한, 현미경 전체를 28℃로 환경 제어되는 실내에 배치하였습니다.&amp;#x00B0;이전 연구들의 해부 과정 중 C&lt;sup&gt;1-3&lt;/sup&gt; 성공적으로.</td></tr><tr><td>Trizol, 100 mL</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 와이어, 직경 0.015인치</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TGW1510</td><td></td></tr><tr><td>나무 어플리케이터</td><td>퓨리턴</td><td>807</td><td>이는 화학적으로 식각된 텅스텐 바늘을 고정하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

zebrafish 배아 눈 조직의 microdissection

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish는 때문에 급속한의 눈 개발에 연구에 인기있는 동물 모델입니다<em&gt; 예 utero</em&gt; 개발과 좋은 생산력. 3 일간 게시물 수정 (DPF)으로, 애벌레는 첫 번째 시각 응답을 표시합니다. 많은 유전자가 적절한 눈 개발을 제어 식별하지만, 우리는 근본적인 유전자 아키텍처의 완전한 이해를 멀리 아르되었습니다. 전체 게놈의 유전자 발현 프로 파일링은 눈 개발을위한 유전자 규제 네트워크를 명료하게하다하는 유용한 도구입니다. 그러나, zebrafish의 배아 눈의 작은 크기는 어려운 표현 분석을위한 온전하고 순수한 눈 조직을 얻을 수 있습니다. 렌즈의 직경이 적은 100 μm의 동안 예를 들어, 2 일 및 3의 눈 앞쪽에 - 후부 길이에만 약 200-300 μm의 수 있습니다. 또한, 망막을 기본 망막 안료 상피 (RPE)는 단지 하나의 레이어 상피이다. 유전자 발현 프로필은 전체 배아에서 얻을 수 있지만, 그들은 정확하게 이러한 조직의 표현을 대변하지 않습니다. 따라서 조직은 순수한 눈 개발의 성공적인 유전자 발현 프로 파일링에 대한 취득해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 눈을 morphogenesis의 주요 단계를 커버 1-3 DPF의 부착 RPE와 함께 그대로 망막과 망막을 microdissect하는 접근 방식을 개발했습니다. 모든 절차는 표준 stereomicroscopes 이하 벌금 포셉 및 일반 실험실 공급을 할 수 있습니다. 망막 절개 들어, 단일 레이어 RPE 제거하고 작업 및 해부를위한 문화 판의 표면에 RPE 잔존물의 특혜 준수 닦고으로 해제 벗겨. RPE 완전히 망막과 보존 수 있도록 RPE 연결된 망막 절개 들어, 해부 접시에 RPE의 준수는 해부하기 전에 제거됩니다. 이 조직의주의 리프팅 작업은 효율적으로 추정 맥락막과 공막엔을 분리할 수 있습니다. 렌즈는 화학적으로 에칭 텅스텐 바늘로 두 경우 모두에서 제거할 수 있습니다. 즉, 우리의 접근 방식은 그대로 눈 조직을 얻을 수 있으며, 성공적으로 zebrafish 망막의 조직 구체적인 표현 프로필을 연구 활용되었습니다<sup&gt; 1, 2</sup&gt; 및 망막 색소 상피<sup&gt; 3</sup&gt;.

이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

제브라피쉬는 빠른 체외 발생과 높은 산란력 덕분에 안구 발달 연구에 널리 사용되는 동물 모델입니다. 수정 후 3일이 되면...

이 영상은 수정 후 1~3일 된 제브라피시 배아의 망막 및 망막 색소 상피(RPE)가 부착된 망막의 미세 절제 과정을 보여줍니다. 모든 과정은 미세 핀셋과 일반 실험실 소모품을 사용하여 수행할 수 있습니다. 망막 절제를 위한 표준 실체 현미경 하에서, 단층 구조인 RPE를 브러싱 동작과 배양 플레이트 표면에 대한 RPE의 부착력을 이용하여 제거하고 벗겨냅니다.RPE 부착 망막 박리를 위해, 박리 전 배양 플레이트의 접착 특성을 배아 압착과 세척을 통해 제거합니다. RPE를 온전하게 보존하기 위해 이 조직을 조심스럽게 들어 올려 맥락막과 공막을 RPE 부착 망막으로부터 효율적으로 분리한 다음, 화학적으로 식각된 텅스텐 바늘을 사용하여 수정체를 제거합니다. 이 박리 방법은 온전한 망막 조직을 얻을 수 있어 조직 특이적 RNA 발현, 제브라피쉬 망막 및 망막 색소 상피의 프로파일 연구에 성공적으로 활용되었습니다.안녕하세요, 저는 퍼듀 대학교 생물과학과의 UFE Leon 교수 연구실 소속 Li Jang입니다. 오늘은 제브라피쉬 배아의 안구 조직을 해부하는 방법을 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 안구 발달을 조절하는 유전자 네트워크를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 여덟 번째로, 미세 절단 전에 다음 용액들을 준비하십시오. E3 배지, 여과 멸균된 링거 용액, 그리고 5 N 수산화나트륨입니다.다음으로, 텅스텐 바늘을 화학적으로 에칭합니다. 비커를 다루기 쉽게 하고 수산화나트륨이 쏟아지는 것을 방지하기 위해, 찰흙을 이용하여 페트리 접시 안에 작은 비커를 고정합니다. 비커 측면에 표준 종이 클립을 부착합니다.클립이 수산화나트륨에 닿을 때까지 비커에 일반 수산화나트륨 5를 붓습니다. DC 전원 공급 장치의 음극을 종이 클립에 연결하고, 양극을 짧은 텅스텐 와이어의 한쪽 끝에 연결합니다. 텅스텐 와이어의 반대쪽 끝을 직경 4mm의 점토 공으로 감싼 후, 이 끝을 수산화나트륨 용액에 담급니다.전압을 약 3V까지 높이고, 수산화나트륨 용액에 와이어를 1초 간격으로 위아래로 담그는 과정을 약 10분 동안 반복합니다. 수산화나트륨에 노출된 텅스텐 와이어는 점차 가늘어지며, 양극에 연결된 와이어의 반대편에서 점토 공이 떨어져 나가면 끝부분이 날카로운 바늘 모양이 됩니다. 링거 용액(ringer solution) 또는 E3 용액으로 날카로운 바늘을 헹구어 염분 침전물을 제거한 후, 배아 해부를 위해 다루기 쉽도록 테이프나 니들 홀더를 사용하여 나무 어플리케이터에 바늘을 부착합니다.번식 전날 밤, 표준 프로토콜에 따라 성체 super fish를 유지 관리합니다. 정적인 번식 탱크에서 격벽을 사용하여 어버이 물고기를 쌍별로 분리합니다. 다음 날 아침 실내 조명을 켠 후 격벽을 제거하고, 30분 간격으로 10분 동안 어버이 물고기가 교배하도록 하며, 매 교배 후에는 물고기를 다시 분리합니다.각 교배에서 수집한 배아를 E three 배지에서 28 °C로 각각 배양하십시오. 수정 후 10~12시간에 배아의 단계를 확인하고, 특정 시점의 해부 직전에 다시 단계를 확인하십시오. 해부 시에는 Falcon 60 x 15 mm 폴리스티렌 배양 플레이트를 사용하십시오.새로운 미사용 플레이트는 약 20분 동안 RPE 조직에 대해 고유한 접착 특성을 가지며, 이는 망막 박리 시 RPE 제거에 도움이 될 수 있습니다. RPE가 부착된 망막이 필요한 경우, 링거액이 담긴 배양 플레이트에서 배아 두 개를 완전히 으깬 후 박리 전 30분 동안 방치하고, 이어서 신선한 링거액으로 충분히 세척함으로써 이러한 접착 특성을 극복할 수 있습니다. 모든 미세 박리는 Olympus SC X 16 현미경의 1x 대물렌즈를 사용하여 약 5~8배 배율에서 수행합니다.Dumont 핀셋이나 화학적으로 식각된 텅스텐 바늘을 사용하여, 현미경 스테이지를 28 °C로 가온합니다. 망막 박리를 시작할 때 온도 변화의 영향을 최소화하기 위해, 특정 발달 단계의 배아를 RRPE 없는 망막 박리법으로 준비된 Falcon 60 by 15 millimeter 배양 플레이트 내 5 mL의 Ringer 용액으로 옮깁니다. 핀셋의 날카로운 끝을 사용하여 머리와 전방 몸통 일부를 빠르게 절단하여 제브라피쉬의 몸통을 제거합니다. 다음으로, 머리와 몸통 절편의 후단을 배양 플레이트에 고정합니다. 보조 핀셋을 사용하여 전두부부터 시작하여 머리의 등쪽을 엽니다.안구의 내측면이 노출되어 이후 조작을 위해 위를 향하도록 뇌를 제거합니다. 망막을 박리하기 위해, 핀셋 끝을 사용하여 위를 향한 안구 내측면의 노출된 RPE를 망막으로 연결되는 작은 틈이 보일 때까지 조심스럽게 쓸어냅니다. 망막의 내측면이 거의 모두 노출될 때까지 쓸어내어 벗겨내는 동작을 계속합니다.배양 접시를 향하고 있는 안구의 망막에서 외측 RPE를 제거할 때, 노출된 망막에 긁힘이나 구멍이 생기지 않도록 주의하십시오. 배양 플레이트 표면으로부터 약 45도 각도를 유지하며 핀셋으로 안구를 가볍게 쓸어내십시오. 분리된 RPE 부분을 배양 플레이트에 고정하여 해부함으로써, 전거톱니모양체(ora serrata)에 비교적 단단하게 부착된 RPE를 제거하십시오.그다음 망막을 조심스럽게 들어 올려 잔류 RPE를 세척하고, 배양 접시의 접착 특성을 이용하여 수정체를 제거합니다. 이때 접시 표면에 가볍게 부착될 망막 세포가 손상되지 않도록 주의하십시오. 굴리기 기법으로 수정체가 분리되지 않을 경우, 에칭된 텅스텐 바늘을 사용하여 수정체 표면을 원형으로 휘저어 분리하십시오.RPE 부착 망막 박리를 시작하려면, RPE 부착 망막 박리용으로 준비된 Falcon 60 by 15 millimeter 배양 플레이트를 사용하십시오. 특정 발달 단계의 배아를 5 mL의 링거액으로 옮깁니다. 머리와 전신 몸통 일부를 절단합니다.이전에 수행한 것과 같이 제브라피시의 몸통을 빠르게 제거합니다. 배양 플레이트 위에 머리 몸통 섹션의 후단을 고정합니다. 보조 핀셋을 사용하여 전두부부터 시작하여 등쪽 방향으로 머리를 엽니다.안구의 내측면이 위를 향하도록 노출시킨 후 뇌를 제거합니다. 핀셋을 사용하여 추가 조작을 수행할 때는 안구의 후외측을 부드럽게 들어 올려 전측으로 굴립니다. RPE 층 바깥쪽의 맥락막과 공막 조직은 피부에 비교적 단단히 부착되어 있으며, 안구를 전측으로 조심스럽게 굴려 대부분 벗겨낼 수 있습니다.망막 박리를 위해 눈의 측면이 노출되고 눈이 여전히 피부에 부착되어 있는 상태에서 텅스텐 바늘을 사용하여 수정체를 제거합니다. RPE와 RPE가 부착된 망막이 없는 상태에서, 박리된 샘플을 이후의 RNA 특성 분석을 위해 RNA re 마이크로 튜브의 triol에 수집할 수 있습니다.RPE가 제거된 성공적인 망막 박리 결과가 여기에 제시되어 있으며, 손상되지 않은 망막 표면에서 알 수 있듯이 망막의 무결성이 유지되었습니다. 해당 조직 절편 또한 망막 구조가 매우 잘 유지되고 있음을 보여줍니다. 특히, 광수용체 층과 RPE 사이의 세포외 기질 보존 상태가 매우 뛰어납니다.성공적으로 RPE가 부착된 망막 박리는 손상 없이 연속적인 RPE 층으로 확인됩니다. 해당 조직 절편을 통해 망막 세포와 RPE 세포 모두 양호한 상태임을 알 수 있습니다. 박리된 망막에서 추출한 총 RNA는 높은 품질을 유지합니다.이는 바이오애널라이저(bioanalyzer) 분석을 통해 얻은 전기영동도와 겔 이미지로 확인할 수 있습니다. 기저선은 평탄하며 18 s 및 28 s 리보솜 피크가 온전하게 나타납니다. RNA 무결성 지수(RNA integrity number)는 일반적으로 9.8보다 큽니다.지금까지 RPE(망막색소상피)가 포함된 경우와 포함되지 않은 경우의 제브라피쉬 배아 망막을 얻기 위한 미세 해부 절차를 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 망막 해부에서 가장 중요한 단계는 포셉 끝을 이용한 브러싱 동작과 조직 롤링임을 기억하는 것이 중요합니다. RPE 잔해를 제거할 때, 해부하는 동안 의자의 조절 가능한 팔걸이에 팔꿈치를 올리면 손의 움직임을 상당히 안정시킬 수 있음을 확인했습니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

microdissection-of-zebrafish-embryonic-eye-tissues

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

렌즈 개발은 다른 조직과 상호 작용을 포함한다. 여러 zebrafish 아이 돌연변이 비정상적으로 작은 렌즈의 크기가 특징입니다. 여기 우리는이 표현형은 본질적 원인이나 렌즈를 둘러싸고있는 조직과 결함이 상호 작용에 의한 있는지 여부를 확인하기 위해 렌즈 이식 실험을 보여줍니다.

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

이 비디오는 성체 및 유충 제브라피시 렌즈를 해부하여 피질 수정체 형태 및 렌즈 봉합사의 구조적 무결성을 분석하기 위해 개발된 프로토콜에 대해 설명합니다.

눈 렌즈 해부: 제브라피시 렌즈 형태를 관찰하는 기술

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

광시트 형광 현미경은 배아 발달을 이미징하기 위한 훌륭한 도구입니다. 이를 통해 생리학적 조건에 가까운 살아있는 배아의 장시간 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다. 우리는 넓은 시공간 규모에 걸쳐 제브라피시 눈 발달을 이미징하기 위한 응용 프로그램을 시연하고 다중 보기 데이터 세트의 융합 및 디콘볼루션을 위한 파이프라인을 제시합니다.

이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여

이 정서의 결과 얻기 위해 단백질 subcellular 지역화 zebrafish 망막에 상관 빛 슈퍼 해상도 현미경 및 전자 현미경 이미지를 검색 하 여 필요한 단계를 설명 합니다.

Zebrafish 망막에 단백질 지 방화를 해결 하기 위해 상호 슈퍼 해상도 전자 현미경 검사 법

여기, 우리는 방법 프로토콜 neoangiogenesis 및 구조적인 변화에 연결 된 장기 혈관 병 리의 설정에서 빠른 읽기로 쉽게 성인 tg(fli:EGFP) zebrafish 망막 맥 관 구조 분석 수 있는 논의.

물고기는 눈을 통해 당뇨병을 공부: 기정, 시각화, 및 성인 tg(fli:EGFP) Zebrafish 망막 맥 관 구조 분석

여기, 우리 제시 우수한 눈 고 랑을 관찰 하는 프로토콜의 표준화 된 시리즈 척추 눈에서 최근 발견, 진화론 보존 구조. Zebrafish 애벌레를 사용 하 여, 형성 및 우수한 눈 고 랑의 폐쇄에 기여 하는 요소를 식별 하는 데 필요한 기술을 설명 합니다.

Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기서, 결과 데이터를 분석하기 위해 상용화된 라이트시트 현미경 및 이미지 프로세싱 워크스테이션을 이용한 안구 형태형성의 타임랩스 이미징을 위한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 배아 마취, 낮은 용융 온도 아가로스에 매립, 이미징 챔버에 서스펜션, 이미징 매개 변수 설정, 마지막으로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미징 데이터를 분석하는 절차를 자세히 설명합니다.

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

배우세요 제브라피시 배아 눈 조직의 미세절단 기법을 통해 망막과 망막색소상피를 분리하는 방법을 Danio rerio에서. 이 기술은 조직 특이적 RNA 발현 연구에 활용됩니다.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

더 많은 동영상 탐색