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암 연구
0 조회수 • 4:31 분 • April 30th, 2023
- 종양에 대한 화학요법 치료는 일반적으로 증식성이 높은 세포를 표적으로 하여 줄기세포 집단의 작은 부분 집합을 남겨 종양의 재발을 유도합니다. 이러한 줄기세포를 측면 집단(side population)이라고 합니다. 측면 집단에는 특정 세포 마커가 없기 때문에 염료 유출 분석을 사용하여 다른 종양 세포로부터 분리합니다.
먼저 분리된 제브라피시 종양 세포에 Hoechst 염료를 첨가합니다. Hoechst는 핵으로 들어가 DNA의 작은 홈에 있는 A-T 풍부한 영역에 결합합니다. 세포의 측면 집단은 표면에 ABC 수송체의 농도가 더 높기 때문에 염료가 세포 외부로 빠르게 유출되어 낮은 형광을 나타냅니다.
Hoesct 처리된 종양 세포의 다른 바이알을 가져다가 베라파밀을 첨가합니다. 이 바이알은 베라파밀이 ABC 수송체를 차단하여 회히스트 유출을 감소시켜 측면 개체군의 형광을 증가시키기 때문에 대조군 역할을 합니다.
대조군 세포와 샘플 세포를 모두 어두운 곳에서 배양합니다. 다음으로, 죽은 세포의 핵에만 독점적으로 들어가 DNA 염기 사이를 삽입하여 죽은 세포를 붉게 염색하는 프로피듐 요오드화물로 세포를 대조합니다. 마지막으로, 형광 활성화 세포 분류기를 사용하여 세포를 분류합니다. 다음 프로토콜에서는 제브라피시에서 종양 세포의 측면 집단을 분리할 것입니다.
- 세포를 염색하기 전에 뉴클레아제가 없는 물에 Hoechst 염료를 희석하여 밀리리터당 1밀리그램의 작업 용액을 얻습니다. 알루미늄 호일로 덮인 준비된 용액을 섭씨 4도에서 보관한 다음 49.1mg의 베라파밀을 1ml의 DMSO에 용해시켜 100마이크로몰 억제제 용액을 얻습니다.
다음으로, FBS/PBS 2.5 μl의 DMSO, 15 μl의 1 milligram per millil Hoechst 염료 및 6개의 종양 세포에 10을 최종 부피 1ml의 FACS 튜브에 추가하여 샘플을 준비합니다.
대조군을 준비하려면 FBS/PBS, 2.5마이크로리터의 100밀리몰 베라파밀, 15마이크로리터의 밀리리터당 1밀리리터 Hoechst 염료를 추가합니다. 6개의 종양 세포에 10을 추가하고 최종 부피는 1ml입니다.
샘플과 대조군을 어두운 곳에서 섭씨 28도의 수조에서 120분 동안 배양합니다. 배양 후에는 세포를 즉시 얼음 위에 놓고 어두운 곳에 보관하십시오.
세포를 300배 G, 섭씨 4도에서 6분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 1 밀리리터의 FB
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