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암 연구
0 조회수 • 5:11 분 • April 30th, 2023
- 오가노이드는 조직 특이적 줄기세포에서 유래한 작은 3차원 세포 배양물입니다. 유전체학적으로 안정적이지만 transfection을 통해 유전적으로 수정할 수 있으므로 유전자 조사에 이상적입니다. transfection의 경우, 특정 배양 배지가 있는 멀티웰 배양 플레이트에 오가노이드를 시드하고 원하는 기간 동안 배양합니다. 다음으로, 오가노이드 세포의 해리를 돕기 위해 플레이트에 해리 혼합물을 추가합니다. 혼합물을 튜브와 원심분리기로 옮깁니다. 오가노이드 펠릿을 형광 표지된 플라스미드 DNA를 포함하는 전기천공법 완충액에 재현탁합니다. 완충액은 세포를 안정화시키고 전기적 스트레스로 인한 세포 사멸을 방지합니다.
혼합물을 큐벳으로 옮기고 세포를 전기천공합니다. 세포막을 가로지르는 전기 충격은 플라스미드 DNA가 세포로 흡수되는 것을 용이하게 하기 위해 일시적인 공극 형성을 초래합니다. electroporation 후에, 즉각 세포 현탁액에 배양 매체를 추가하고 관에 혼합물을 옮깁니다. 이제 세포를 원심분리합니다. 펠릿을 basement matrix에 재현탁시키고 중합을 위해 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 형광 현미경 아래에 놓고 세포의 형광을 확인하여 효율적인 transfection을 확인합니다. 다음 프로토콜에서는 위장 오가노이드를 transfection하기 위해 electroporation을 수행합니다.
- 전기천공 후 파종을 위해 섭씨 37도에서 48웰 플레이트를 사전 예열하는 것으로 시작한 다음 원고 지침에 따라 기저 및 오가노이드 배양 전용 배지를 준비합니다. 48웰 플레이트에서 전기천공법 시료당 5웰의 오가노이드를 배양합니다. 웰당 10마이크로몰 Y27632로 230마이크로리터의 해리 시약을 준비합니다. 현미경으로 오가노이드를 모니터링합니다. 웰에서 배양 배지를 제거하고 준비된 해리 혼합물에서 오가노이드를 기계적으로 해리합니다. 전기천공법 시료당 5개의 웰을 하나의 15ml 튜브에 풀링합니다.
튜브의 내용물을 와류로 혼합하고 섭씨 37도에서 10-15개의 세포 클러스터가 발생할 때까지 5-15분 동안 배양하고 현미경으로 해리를 확인합니다. 항생제 없이 최대 10ml의 기초 배지를 추가하여 소화를 중단하십시오. 튜브를 450회 g으로 5분 동안 원심분리한다. 상등액을 버리고 4ml의 electroporation buffer로 세포를 두 번 세척합니다. 세척할 때마다 상층액을 원심분리기로 분리하
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