췌장 세포의 칼슘 역학 이미징: 췌장 섬의 세포질 칼슘 농도의 실시간 변화를 연구하는 기술

- 췌장섬(pancreatic islets)은 포도당 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 호르몬 생성 췌장 세포의 집합체입니다. 포도당 농도가 높아지면 칼륨 이온 채널의 폐쇄가 유발되어 칼륨 이온 유출을 방지하여 막 탈분극을 유발합니다. 결과적으로 전압 의존성 칼슘 이온 채널이 열려 칼슘 이온의 유입이 가능합니다. 이렇게 증가된 세포질 칼슘 농도는 인슐린과 같은 호르몬의 방출을 자극합니다. 실시간으로 세포질 칼슘 역학을 이미지화하려면 적절한 칼슘 지시약 염료가 로드된 몇 개의 섬을 사전 조립된 미세 메쉬의 스페이서 벽 사이로 옮깁니다.

도립 현미경의 이미징 챔버 내부에 설정된 커버슬립에 메쉬를 거꾸로 놓습니다. 거친 메쉬와 무게를 배치하여 세포를 고정시킵니다. 챔버에 이미징 솔루션을 추가합니다. 다음으로, 포도당 또는 관심 있는 테스트 호르몬을 도입하기 위해 관류 시스템을 설정합니다. 세포 내에서 사전 로드된 형광 칼슘 지표는 세포질 칼슘 농도의 증가를 보고합니다. 칼슘 이온에 결합하면 지표 분자는 형광 방출이 크게 증가합니다. 다음 프로토콜에서는 포도당 관류에 대한 반응으로 쥐 췌장섬에서 칼슘 역학의 실시간 이미징을 보여줍니다.

- 이미징을 위해 섬을 고정시키려면 도립 현미경용 이미징 챔버를 조립하고 챔버 내부에 유리 커버슬립을 놓습니다. 유리 챔버 인터페이스가 방수되는지 확인하고 커버슬립이 현미경 대물렌즈의 범위 내에 있는지 확인합니다. 다음으로, 20 X 20mm 정사각형의 미세하고 거친 메쉬를 자르고 45-50마이크로미터의 두꺼운 접착 테이프를 사용하여 미세한 메쉬 조각에 두 개의 스페이서 벽을 만듭니다. 거친 메쉬와 추를 35mm 페트리 접시의 이미징 용액에 담그고 미세한 메쉬를 해부 현미경 아래에 놓습니다.

스페이서 벽이 거꾸로 되어 있고 스페이서가 위쪽을 향하도록 미세한 메쉬를 뒤집고 P20 피펫을 사용하여 두 스페이서 사이에 여러 개의 섬을 옮깁니다. 워치메이커의 집게를 사용하여 도립 현미경의 이미징 챔버 내부에 메쉬를 거꾸로 배치하여 스페이서가 아래를 향하도록 하여 챔버 커버슬립에 직접 안착되도록 하여 스페이서와 커버슬립 중앙의 메쉬 사이에 섬을 가둡니다.

- 메쉬가 샘플의 측면 움직임을 유발할 수 있는 과도한 양의 용액을 포함하지 않고 잘 수화되어 있는지 확인하십시오.

- 그런 다음 챔버의 미세한 메쉬 위에 거친 메쉬와 무게를 놓고 챔버에 이미징 용액을 추가합니다. 섬이 고정되면 도립 현미경에서 이미징 모드와 대물렌즈를 선택하고 섬이 있는 챔버를 현미경의 온도 제어 스테이지에 놓습니다. perifusion을 설정한 후 유입을 챔버 내 유출보다 낮게 배치하고 유출 플럭스를 유입 플럭스보다 크게 설정합니다.

유출이 용액과의 접촉을 최소화하여 연속적인 용액 제거의 긴 간격을 기다리는 여러 개의 순차적인 작은 방울로 용액을 제거하도록 합니다. 다음으로, 3 millimolar glucose를 함유한 이미징 용액으로 perifusion을 시작하고 녹색 형광단을 이미징하기 위한 광 경로와 필터를 선택합니다. 그런 다음 라이브 이미징을 실행하여 이미징 매개변수를 설정하고 보기를 조정하여 관심 있는 섬을 캡처합니다.

이미지의 신호 대 잡음비를 최적화하려면 여기광 강도, 노출 시간 및 비닝을 조정하여 설정이 가능한 최소한의 광 강도와 노출에서 섬 내의 각 셀을 뚜렷하게 시각화할 수 있도록 합니다. 그런 다음 0.1 - 5 Hz에서 섬을 이미지화하여 캡처된 수집된 데이터의 품질을 확인합니다.