Primary Acinar Cell Isolation: 마우스 췌장에서 Acinar 세포를 분리하는 방법

- 췌장 아시나르 세포(pancreatic acinar cell)는 다양한 소화 효소를 포함하는 외분비 세포입니다. 때때로, 발암 신호에 대한 반응으로, acinar cell은 ductal cell로 전환됩니다. 이 관 세포는 나중에 암이 될 수 있습니다. 따라서 췌장암 진행에 대한 역할을 연구하기 위해 acinar 세포를 분리하는 것이 중요합니다.

안락사된 쥐로부터 췌장을 분리하는 것으로 시작합니다. 항생제가 보충된 균형 잡힌 소금 용액이 들어 있는 계량 보트에 췌장을 추가합니다. 가위를 사용하여 췌장을 작은 조각으로 다지고 췌장 조직을 튜브에 추가합니다. 다음으로, 튜브의 췌장 조각에 콜라겐분해효소 용액을 추가합니다.

콜라겐분해효소는 조직을 함께 유지하는 콜라겐을 소화하여 조직이 미세한 조각으로 부서지도록 합니다. 이제 튜브에 혈청 함유 배지를 추가하고 조직을 얼음 위에 놓습니다. 이것은 콜라겐 분해 효소의 작용을 멈추는 데 도움이 됩니다.

조직과 매체를 두 번 여과하고 매번 필터의 메쉬 크기를 점진적으로 줄여 미세 조직 현탁액을 얻습니다. 마지막으로, 생성된 현탁액을 원심분리하여 펠릿 내의 acinar 세포를 수집합니다. 상층액을 제거하고 추가 분석을 위해 acinar 세포를 보관합니다. 다음 프로토콜에서는 안락사된 쥐의 췌장에서 acinar 세포를 분리합니다.

- 안락사된 쥐의 췌장을 해부하려면 먼저 쥐의 발을 폴리스티렌 뚜껑에 고정하고 꼬리가 연구원을 향하도록 방향을 잡고 복부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 오토클레이브 집게를 사용하여 정중선의 털과 피부를 들어 올리고, 오토클레이브 가위로 요도 개구부에서 횡격막-흉곽 부위까지 털과 피부를 절개합니다. 왼쪽과 오른쪽을 추가로 절개하여 털과 피부를 잘라내고 복강을 명확하게 볼 수 있습니다.

그런 다음 복막 내벽을 중앙과 오른쪽, 왼쪽으로 자르고 장기에서 떼어냅니다. 집게를 사용하여 장을 들어 올려 마우스의 왼쪽으로 이동하여 짙은 빨간색 타원형 비장에 부착된 밝은 분홍색 췌장을 볼 수 있는 공간을 만듭니다. 췌장 조직은 부드럽고 스폰지 같은 질감을 갖습니다. 위를 따라 달리며 장과 얽혀 있는 췌장을 잘라냅니다.

췌장에서 비장을 분리하고 1X 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HBSS 10밀리리터가 들어 있는 50밀리리터 튜브에 췌장을 넣고 층류 후드로 옮깁니다. 튜브의 내용물을 빈 계량 보트에 붓고 집게를 사용하여 췌장을 휘젓고 씻습니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 췌장을 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HBSS가 들어 있는 두 번째 계량 보트로 옮기고 소용돌이치며 다시 씻습니다.

췌장을 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HBSS가 들어 있는 세 번째 계량 보트로 옮기고 췌장을 5mm 이하의 조각으로 자르기 시작합니다. 계량 보트의 내용물을 새 50ml 튜브에 붓으려면 먼저 집게를 사용하여 보트가 기울어질 때 췌장 조각을 액체 속으로 옮깁니다. 조각이 더 이상 보트에 부착되지 않으면 내용물을 튜브에 붓습니다. 집게로 남은 조각을 집어 들고 튜브에서 집게를 씻습니다.

섭씨 4도에서 중력의 931배로 튜브를 2분 동안 원심분리한 후 5ml 피펫을 사용하여 HBSS와 떠다니는 지방을 제거합니다. HBSS에 희석된 콜라겐분해효소 5ml를 추가합니다. 튜브를 닫고 튜브를 플라스틱 파라핀 필름으로 싸서 밀봉된 뚜껑을 확인합니다. 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 220RPM으로 20분 동안 흔들면 탁한 용액과 남아 있는 조직 조각이 거의 나오지 않습니다.

해리를 멈추려면 튜브를 얼음 위에 놓고 5% FBS가 함유된 차가운 HBSS 5ml를 첨가합니다. 섭씨 4도에서 중력의 931배로 2분간 원심분리한 후 5ml 피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다. 펠릿을 5% FBS가 포함된 HBSS 10ml에 재현탁시키고 중력의 931배에서 섭씨 4도에서 2분 동안 다시 원심분리합니다.

5ml 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 5% FBS가 함유된 HBSS 10ml로 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 펠릿을 5% FBS가 함유된 HBSS 5밀리리터에 재현탁합니다. P1000 피펫을 사용하여 500마이크로미터 메쉬를 통해 한 번에 1밀리리터의 셀 현탁액을 50밀리리터 튜브로 여과합니다.

그물망을 통해 남아있는 췌장 세포를 씻어내려면 5% FBS가 함유된 HBSS 5ml를 추가로 첨가하십시오. 그런 다음 P1000 피펫을 사용하여 한 번에 1밀리리터의 여과액을 105마이크로미터 메쉬를 통해 50밀리리터 튜브에 통과시킵니다. 이 세포 현탁액을 30% FBS가 함유된 HBSS가 포함된 50ml 튜브에 부드럽게 피펫으로 넣으면 상단에 세포 현탁액 층이 형성됩니다.

이 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 중력의 233배로 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. acinar 세포를 포함하는 펠렛을 1X Waymouth의 complete medium에 재현탁합니다.