콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

- 췌장의 섬세포는 내분비 기능에 관여하는 필수 호르몬을 생성합니다. 섬을 격리하려면 먼저 안락사된 쥐를 확보하고 수술로 복강을 노출시킵니다. 간과 장을 옆으로 털어내어 총담관을 찾아 고정합니다. 췌장관과 총담관의 결합에 의해 형성된 관인 Vater의 앰풀라(ampulla)를 확인합니다.

다음으로, 콜라겐분해효소 용액을 총담관에 주입합니다. 관으로부터의 역류는 췌장을 성공적으로 팽창시켜 췌장 조직의 콜라겐 분해 효소에 의한 해리를 촉진합니다. 췌장을 절제하여 더 많은 콜라겐 분해 효소 용액이 들어있는 튜브로 만듭니다. 조직을 기계적으로 자르고 콜라겐 분해 효소에 의한 조직 소화를 돕기 위해 배양합니다.

균질한 현탁액을 얻으면 콜라겐분해효소 활성을 억제하는 단백질이 포함된 용액을 첨가하여 효소 분해를 중단합니다. 조직 펠릿을 모으기 위한 원심분리기. 펠릿을 적절한 밀도의 구배 매체에 재현탁시키고, 그 위에 적절한 완충액을 층을 쌓고, 원심분리하여 구배 층을 생성합니다.

밀도 구배 매질과 완충액 사이에 형성된 층에서 섬을 수집합니다. 마지막으로, 배양을 위해 건강한 섬을 선택하십시오. 다음 프로토콜에서는 콜라겐분해효소 투여 후 밀도 구배 원심분리에 의한 쥐 췌장섬의 분리를 입증할 것입니다.

- 누운 자세로 마우스의 팔다리를 테이프로 붙이고 몸에 70 % 에탄올을 분사하는 것으로 시작합니다. 커버 유리 집게와 구부러진 수술용 가위를 사용하여 약 3cm의 수평 복부 피부를 절개하고 피부를 당겨 복벽을 노출시킵니다. 복복막을 3-4cm 수직으로 절개하여 췌장을 완전히 노출시키고 생쥐를 해부 현미경 아래에 놓습니다.

간엽을 상부하게 밀어 창백한 분홍색 관으로 나타나는 담관을 노출시키고 오른쪽 요추와 장골 부위에서 복강 오른쪽으로 장을 부드럽게 움직여 담관과 간동맥을 노출시킵니다. Schwartz Micro Serrefines를 사용하여 총담관을 가능한 한 간에 가깝게 조심스럽게 고정하고 십이지장 유두에 위치하며 췌관과 총담관의 결합에 의해 형성된 Vater의 앰풀라를 식별합니다.

Micro Adson 겸자를 사용하여 총담관을 팽팽하게 당기고, 3밀리리터의 갓 준비된 콜라겐 분해 효소 P 용액이 들어 있는 3밀리리터 주사기에 부착된 30게이지 1/2인치 바늘을 Vater의 앰풀라에 삽입하고 혈관 길이의 약 1/4 동안 혈관과 평행한 덕트로 바늘을 밀어 넣습니다. 바늘이 제자리에 놓이면 Micro Adson 겸자로 바늘을 고정하고 천천히 그리고 꾸준히 3ml의 콜라겐 분해 효소 P 용액을 덕트에 주입합니다. 주사는 췌장의 머리, 목, 몸통 및 꼬리 부분이 완전히 팽창된 경우 성공적인 것으로 간주됩니다.

- 앰풀라(ampulla)로의 적절한 진입과 총담관의 캐뉼레이션(cannulation)은 성공적인 소화 수확을 위해 매우 중요합니다. 덕트 벽을 뚫으면 분리의 효능이 감소합니다.

- 구부러진 집게와 마이크로 애드슨 겸자를 사용하여 부풀어 오른 췌장을 비장에서 시작하여 위와 십이지장을 따라 계속 조심스럽게 당겨 빼냅니다. 그런 다음 췌장을 3ml의 얼음처럼 차가운 콜라겐 분해 효소 P 용액이 들어 있는 50ml 소화 튜브에 넣습니다. 섬을 채취하려면 먼저 미세한 수술 용 가위를 사용하여 췌장을 3-5 초 동안 절단 한 다음 튜브를 섭씨 37도 수조에 넣고 12-13 분 동안 분당 100-120 회전합니다.

배양이 끝나면 약 30초 동안 튜브를 부드럽게 흔들어 용액이 균일해질 때까지 조직을 파괴하고, 이는 미세한 모래 같은 췌장 조직 입자로 확인됩니다. 조직이 소화되자마자 튜브를 얼음 위에 놓고 40ml의 얼음 저온 정지 용액을 첨가하여 효소 반응을 종료합니다. 펠릿을 부드럽게 파괴한 후 스윙 버킷 원심분리기에서 소화 조직을 회전시킨 다음 세척당 20ml의 신선한 정지 용액으로 두 번의 원심분리를 수행합니다.

마지막 세척 후, 펠릿을 40ml의 얼음처럼 차가운 HBSS에 재현탁하여 3회 추가 세척하고, 마지막 세척 후 펠릿을 5ml의 실온 밀도 구배 용액에 재현탁합니다. 용액이 균질화될 때까지 튜브를 저속으로 잠시 소용돌이치게 한 후 튜브에 5ml의 실온 밀도 구배를 더 추가합니다. 이제 10mm 피펫을 사용하여 10mm의 실온 HBSS를 드롭 방식으로 튜브에 부드럽고 천천히 추가하여 그래디언트를 형성하고, 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 밀도 구배 분리를 통해 세포 집단을 분리합니다.

원심분리가 끝나면 10ml 피펫을 사용하여 차가운 HBSS로 미리 적셔 밀도 구배와 HBSS 사이의 섬 층을 5-10ml를 수집합니다. 얼음처럼 차가운 신선한 HBSS 20ml가 들어 있는 새로운 50ml 튜브로 섬을 옮기고 스윙 버킷 원심분리기에서 원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액의 마지막 3ml를 제외한 모든 것을 조심스럽게 흡인하고 세척당 20ml의 신선한 HBSS로 섬을 최소 3회 더 세척합니다.

마지막 세척 후 상등액을 섭씨 37도 RPMI 1640 매체 4밀리리터로 교체하고 튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 펠릿을 제거합니다. 즉시 섬을 100mm 페트리 접시에 붓고 5ml의 신선한 RPMI 1640 배지로 튜브를 세척하여 남은 섬을 수집하고 세척을 다른 섬과 함께 모읍니다.

그런 다음 해부 현미경과 20마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 페트리 접시에서 표면이 매끄럽고 건강한 구형 또는 직사각형 황금빛 갈색 섬을 선택하여 10ml의 완전한 RPMI 1640 배지가 들어 있는 새 페트리 접시로 옮깁니다. 모든 섬을 채취한 후 섬을 섭씨 37도의 멸균 인큐베이터에 넣고 5% 이산화탄소를 가습된 공기에 밤새 넣습니다.