콜라겐분해효소 관류를 통한 췌장섬 분리: 췌장섬 세포를 분리하는 효소 방법

- 췌장의 섬세포는 내분비 기능에 관여하는 필수 호르몬을 생성합니다. 섬을 격리하려면 먼저 안락사된 쥐를 확보하고 수술로 복강을 노출시킵니다. 간과 장을 옆으로 털어내어 총담관을 찾아 고정합니다. 췌장관과 총담관의 결합에 의해 형성된 관인 Vater의 앰풀라(ampulla)를 확인합니다.

다음으로, 콜라겐분해효소 용액을 총담관에 주입합니다. 관으로부터의 역류는 췌장을 성공적으로 팽창시켜 췌장 조직의 콜라겐 분해 효소에 의한 해리를 촉진합니다. 췌장을 절제하여 더 많은 콜라겐 분해 효소 용액이 들어있는 튜브로 만듭니다. 조직을 기계적으로 자르고 콜라겐 분해 효소에 의한 조직 소화를 돕기 위해 배양합니다.

균질한 현탁액을 얻으면 콜라겐분해효소 활성을 억제하는 단백질이 포함된 용액을 첨가하여 효소 분해를 중단합니다. 조직 펠릿을 모으기 위한 원심분리기. 펠릿을 적절한 밀도의 구배 매체에 재현탁시키고, 그 위에 적절한 완충액을 층을 쌓고, 원심분리하여 구배 층을 생성합니다.

밀도 구배 매질과 완충액 사이에 형성된 층에서 섬을 수집합니다. 마지막으로, 배양을 위해 건강한 섬을 선택하십시오. 다음 프로토콜에서는 콜라겐분해효소 투여 후 밀도 구배 원심분리에 의한 쥐 췌장섬의 분리를 입증할 것입니다.

- 누운 자세로 마우스의 팔다리를 테이프로 붙이고 몸에 70 % 에탄올을 분사하는 것으로 시작합니다. 커버 유리 집게와 구부러진 수술용 가위를 사용하여 약 3cm의 수평 복부 피부를 절개하고 피부를 당겨 복벽을 노출시킵니다. 복복막을 3-4cm 수직으로 절개하여 췌장을 완전히 노출시키고 생쥐를 해부 현미경 아래에 놓습니다.

간엽을 상부하게 밀어 창백한 분홍색 관으로 나타나는 담관을 노출시키고 오른쪽 요추와 장골 부위에서 복강 오른쪽으로 장을 부드럽게 움직여 담관과 간동맥을 노출시킵니다. Schwartz Micro Serrefines를 사용하여 총담관을 가능한 한 간에 가깝게 조심스럽게 고정하고 십이지장 유두에 위치하며 췌관과 총담관의 결합에 의해 형성된 Vater의 앰풀라를 식별합니다.

Micro Adson 겸자를 사용하여 총담관을 팽팽하게 당기고, 3밀리리터의 갓 준비된 콜라겐 분해 효소 P 용액이 들어 있는 3밀리리터 주사기에 부착된 30게이지 1/2인치 바늘을 Vater의 앰풀라에 삽입하고 혈관 길이의 약 1/4 동안 혈관과 평행한 덕트로 바늘을 밀어 넣습니다. 바늘이 제자리에 놓이면 Micro Adson 겸자로 바늘을 고