스페로이드의 면역형광 염색: 세포 내 및 세포 외 항원 발현을 위한 스페로이드를 분석하는 기술

- 스페로이드는 3차원 체외 세포 배양 모델입니다. 면역형광 염색의 경우, 먼저 멀티웰 플레이트에서 필요한 세포 유형의 스페로이드 배양물을 생성합니다. 넓은 오리피스 팁이 있는 마이크로피펫을 사용하여 전단력으로 인한 파열을 방지하기 위해 주의하면서 스페로이드를 수집합니다.

다음으로, 스페로이드를 고정하고 투과시켜 개별 세포를 투과할 수 있도록 합니다. 이제 단백질이 포함된 용액으로 배양하여 세포 표면의 비특이적 단백질 상호 작용 부위를 차단하십시오. 원하는 1차 항체 칵테일로 스페로이드를 처리합니다. 항체가 세포 표면의 표적 분자에 결합할 수 있도록 배양합니다.

다음으로, 1차 항체에 특이적인 형광 표지된 2차 항체 용액으로 스페로이드를 라벨링합니다. 마지막으로, 스페로이드를 적절한 형광 DNA 결합 염료로 처리하여 세포핵을 염색합니다. 레이저 스캐닝 형광 현미경을 사용하여 서로 다른 광학 평면에서 스페로이드의 여러 광학 단면을 이미지

캡처된 이미지는 형광 표지된 핵과 관심 항원을 반영합니다. 관련 소프트웨어를 사용하여 스택을 병합하여 3D 스페로이드의 최종 합성 이미지를 얻을 수 있습니다. 다음 프로토콜에서는 자극제인 TGF beta 1의 존재 하에서 배양된 췌장 섬유아세포 및 암 관련 섬유아세포의 스페로이드에 대한 면역형광 염색을 수행합니다.

- 먼저 피펫 끝의 끝을 잘라 구멍을 확대합니다. 배양이 완료된 후 이 절단된 피펫 팁을 사용하여 실험 조건별 또는 분석할 단백질당 하나의 1.5ml 반응 튜브에 스페로이드를 수집합니다. 스페로이드를 1,000배 g으로 약 30-60초 동안 원심분리합니다. 피펫팅으로 상등액을 함유한 메틸셀룰로오스를 조심스럽게 제거하고 펠릿화된 스페로이드를 방해하지 않도록 합니다.

- 스페로이드를 반응관으로 옮길 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 팁을 절단하여 전단 응력이 없는지 확인하십시오. 모든 스페로이드를 수집하는 것도 중요합니다. 세척 단계에서 흡인으로 인해 스페로이드를 잃지 않도록 하십시오.

- 50 마이크로 리터의 1X PBS에서 스페로이드를 세척하려면 1,000 회 g에서 30-60 초 동안 원심 분리기를 수행 한 다음 피펫팅으로 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 염색할 단백질에 따라 PBS에 50마이크로리터의 4% 파라포름알데히드로 스페로이드를 실온에서 20분 동안 고정합니다.

앞에서 설명한 대로 PBS로 스페로이드를 세척합니다. PBS에 0.1% Triton X를 넣고 실온에서 4분 동안 세포를 투과합니다. 그런 다음 앞에서 설명한 대로 PBS에서 스페로이드를 세 번 세척합니다. 5% FBS 및 2% BSA를 함유한 PBS를 스페로이드에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 단백질 상호 작용 부위를 차단합니다.

이제 섭씨 4도에서 2.5% FBS 및 1% BSA를 사용하여 PBS에서 30마이크로리터의 1차 항체로 스페로이드를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 앞에서 설명한 대로 PBS에서 스페로이드를 세 번 세척합니다.

그 후, 2.5% FBS 및 1% BSA와 함께 PBS에 30마이크로리터의 2차 항체와 함께 스페로이드를 실온에서 90분 동안 배양합니다. 앞에서 설명한 대로 PBS에서 스페로이드를 세 번 세척합니다.

다음으로, 실온에서 4분 동안 30마이크로리터의 DAPI 염색 용액으로 세포를 배양합니다. 앞에서 설명한 대로 PBS에서 스페로이드를 한 번 세척합니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBS 한 방울의 유리 슬라이드에 스페로이드를 놓습니다. 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 10배 배율로 형광 현미경으로 스페로이드를 이미지화합니다. Z-스택의 서로 다른 광학 평면에서 스페로이드의 다른 광학 단면을 취합니다.