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암 연구
0 조회수 • 5:39 분 • April 30th, 2023
- 췌장암 세포는 종양 미세환경 또는 TME에서 암 관련 섬유아세포와 상호 작용합니다. 이러한 상호 작용은 암세포의 대사 활동을 조절하고 암 진행에 영향을 미칩니다.
스페로이드는 in vitro에서 TME를 재현하는 세포 응집체입니다. 따라서 이러한 스페로이드를 사용하여 세포외 플럭스 분석을 통해 종양의 대사 기능 변화를 테스트할 수 있습니다. 이 분석은 산소와 양성자의 세포 외 농도를 측정하여 각각 호기성 및 해당작용 대사를 측정합니다.
췌장암 세포와 췌장 섬유아세포를 공동 배양하여 만든 적절한 크기의 3D 스페로이드를 복용하는 것으로 시작합니다. 이제 스페로이드를 플럭스 분석 플레이트로 옮기고 테스트 약물이 들어 있는 센서 카트리지로 덮습니다. 세포외 플럭스 분석기에서 분석을 실행합니다.
플럭스 분석기는 특정 시점에서 센서 카트리지에서 분석 플레이트로 테스트 약물을 공압으로 주입합니다. 테스트 약물에 대한 반응으로 세포는 양성자와 산소를 플레이트 마이크로 챔버로 방출하고 센서 프로브에 존재하는 형광단은 이러한 수준을 측정합니다. 마지막으로 적절한 소프트웨어를 사용하여 스페로이드의 기능을 분석합니다.
다음 프로토콜에서는 세포외 플럭스 분석을 사용하여 3D 스페로이드에 존재하는 췌장 종양 세포의 대사 기능을 측정하는 방법을 시연합니다.
대사 분석 전날, 제공된 유틸리티 플레이트에서 웰당 200마이크로리터의 분석 캘리브러트로 프로브 카트리지를 수화하고 가습된 섭씨 37도의 비CO2 인큐베이터에서 유틸리티 플레이트를 밤새 배양합니다.
다음 날 아침, 광학 현미경으로 성장판의 스페로이드를 관찰하여 형태와 전반적인 균일성을 확인합니다. 성장판을 자기 홀딩 드라이브로 옮기고 웰당 약 120마이크로리터의 성장 배지를 조심스럽게 흡입합니다.
120마이크로리터의 따뜻한 분석 매체로 스페로이드를 부드럽게 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 현미경으로 스페로이드를 다시 검사하여 스페로이드가 씻겨 나가지 않았는지 확인하고 각 웰에 180마이크로리터의 따뜻한 분석 배지를 추가합니다.
넓고 뚫린 팁을 사용하여 세포 기피제 성장 플레이트에서 사전 세척된 단일 스페로이드를 조심스럽게 흡인하고 스페로이드를 스페로이드 분석 플레이트의 한 웰 중앙으로 직접 부드럽게 옮겨 스페로이드가 중력에 의해 웰의 중앙 마이크로 챔버로 떨어지도록 합니다.
모든 스페로이드가 옮겨졌을 때, 분석 플레이트를 CO2가 아닌 섭씨 37도의 가습 공기 인큐베이터에 1시간 동안 놓습니다. 배양하는 동안 A에서 H행이 왼쪽에 오도록 센서 카트리지의 방향을 지정하고 로드할 포트에 해당하는 문자가 왼쪽 상단 모서리에 오도록 카트리지 상단에 로딩 가이드를 배치합니다.
플레이트가 균일하게 로드된 경우 해석 소프트웨어를 열고 템플릿을 클릭합니다. Blank Template을 두 번 클릭하고 Generate Groups를 클릭합니다. Plate Map 탭에서 실험 설계에 해당하는 분석 플레이트에 그룹을 할당하고 4개의 모서리 웰을 배경 웰로 선택합니다.
Instrument Protocol 탭에서 Calibrate, Equilibrate 및 baseline Measurements Cycle을 선택합니다. Injections(주입)를 클릭하고 각 포트에 대한 화합물을 정의합니다. 측정 주기를 6으로 변경합니다. Protocol and Group(프로토콜 및 그룹) 요약을 검토한 다음 분석 설계 템플릿을 저장합니다.
분석 설계를 가이드로 기반으로 멀티채널 피펫을 사용하여 각 시약을 주입 포트에 직접 분주하고 손가락 끝으로 로딩 가이드를 제자리에 고정합니다. 모든 시약이 로드되면 로딩 가이드를 제거하고 카트리지를 눈높이에 대고 주입 포트가 균일하게 로드되었는지 육안으로 검사합니다.
카트리지와 유틸리티 플레이트를 세포외 플럭스 분석기로 옮기고 사전 분석 보정을 시작합니다. 보정이 완료되면 유틸리티 플레이트를 3D 스페로이드가 포함된 예열된 분석 플레이트로 교체하고 분석을 시작합니다. 분석이 완료되면 데이터를 적절한 데이터 분석 소프트웨어로 내보냅니다.