JoVE 실험 백과사전
암 연구
0 조회수 • 5:08 분 • April 30th, 2023
- 녹색 형광 단백질 또는 GFP를 발현하는 암세포는 비침습적 광학 이미징을 통해 종양 성장 및 전이를 모니터링할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 이러한 세포를 종양 미세환경을 재현하고 종양 세포와 주변 환경의 상호 작용을 모방할 수 있는 orthotopic 모델에 이식합니다.
마취된 마우스를 따뜻한 발열 패드에 올려 놓는 것으로 시작합니다. 이제 코를 코 마스크에 삽입하여 산소와 마취제인 이소플루란을 공급합니다. 가위를 사용하여 작은 절개를 만들고 조직을 자릅니다. 췌장과 함께 비장을 부드럽게 당겨 빼내고 췌장 꼬리를 찾습니다.
형광 암세포 현탁액이 있는 주사기를 장전하고 췌장 꼬리에 부드럽게 주입합니다. 주입된 부위에 표재성 기포가 나타나 성공적인 이식을 확인합니다. 장기를 체강에 다시 삽입하고 멸균 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 이제 마우스를 케이지로 되돌리고 복구될 때까지 모니터링하십시오.
원하는 시간이 지나면 마우스를 이미징 챔버에 놓고 이미지를 촬영합니다. 광선은 암세포에 부딪히고 GFP를 자극하여 녹색 형광을 생성합니다. 다음 프로토콜에서는 정소성 쥐 모델에서 GFP 발현 췌장암 세포의 외과적 이식을 수행합니다.
세포를 이식하려면 먼저 마취된 쥐의 눈에 연고를 바르고 멸균 커튼으로 덮인 발열 패드에 동물을 놓습니다. 그런 다음 요오드 스크럽 3회에 이어 70% 에탄올 헹굼 3회를 통해 동물의 옆구리를 부드럽게 소독한다. 발가락 꼬임에 대한 반응 부족을 확인한 후, 약 200마이크로리터의 준비된 세포를 18게이지 바늘이 장착된 사전 냉각된 1ml TB 주사기에 로드합니다.
18 게이지 바늘을 27 게이지 바늘로 교체하고 세포를 다시 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 복부의 왼쪽 상단 사분면에서 비장의 일반적인 영역을 찾습니다. 집게를 사용하여 비장 위의 피부를 꼬집고 약 1cm 절개를 만들어 주머니를 만듭니다. 그런 다음 비장 상단의 평활근을 꼬집고 조직을 잘라 복막강에 접근합니다.
다음으로, 비장의 꼬리 끝을 부드럽게 잡고 체강 밖으로 빼냅니다. 젖은 멸균 면봉을 사용하여 비장 끝에 붙어있는 췌장을 펴서 췌장 꼬리를 찾습니다. 50마이크로리터의 세포를 췌장 꼬리로 전달합니다. 그런 다음 췌장에서 바늘을 천천히 회전시킵니다.
성공적인 이식은 누출이 없는 표면 거품처럼 보일 것입니다. 장기를 복막강으로 되돌리고 모든 것을 근육과 피부로 둘러쌉니다. 그런 다음 6-0 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 그 후, 동물에게 케토프로펜을 주사하고 완전히 회복될 때까지 모니터링한다. 적절한 실험 시점에서, 상용 소동물 이미지 시스템을 사용하여 마취 중인 살아있는 동물의 종양 성장을 이미지화하고 적절한 여기 및 방출 필터를 선택합니다.
다음으로, 백색광만 사용하여 초기 이미지를 얻습니다. 동물을 같은 위치에 두고 GFP 필터로 전환하고 두 번째 이미지를 획득합니다. 종양 성장을 분석하려면 백색 이미지와 형광 이미지를 중첩하여 종양 세포의 형광 영역과 강도를 평가합니다.