0 조회수 • 3:14 분 • April 30th, 2023
- 췌장암 줄기세포(CSC)는 자가 재생 암세포의 하위 집합이며 전체 종양을 유발할 수 있습니다. CSC는 섬유아세포, 면역 세포, 내피 세포, 사이토카인 및 성장 인자와 같은 세포 외 기질 구성 요소와 같은 다른 세포로 구성된 잘 보호된 틈새에 상주합니다. 이러한 환경에서 세포 간에 발생하는 상호 작용은 CSC가 전파되고 종양 성장을 증가시키는 데 도움이 됩니다.
CSC의 특성을 연구하기 위해 CSC를 췌장 종양에서 분리합니다. CSC 성장 배지에서 인간 췌장 종양 조직의 세포 현탁액을 채취하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 주로 섬유아세포와 CSC로 구성된 현탁액을 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 시딩하고 원하는 기간 동안 배양합니다. 섬유아세포는 젤라틴 표면에 부착되어 세포 현탁액에 자유 부유 CSC를 남깁니다.
소량의 세포 현탁액을 취하고 trypan blue를 추가합니다. 이 혼합물을 혈구계에 피펫으로 넣고 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. 트리판 블루는 죽은 세포에 들어가 파란색으로 염색하여 살아있는 세포를 무색으로 만듭니다. 마지막으로, 추가 분석을 위해 CSC를 저장합니다.
다음 프로토콜에서는 CSC를 췌장 종양에서 분리합니다.
- 멸균된 생물 안전 캐비닛에서 췌관 선암종의 암 줄기 세포를 분리하려면 멸균 메스와 겸자를 사용하여 1ml의 멸균 PBS가 포함된 60 x 15mm 배양 접시에서 인간 종양을 다지고 조직이 완전히 해리될 때까지 필요에 따라 3-4ml의 PBS를 추가합니다.
조직 현탁액을 멸균 원뿔형 튜브로 옮기고 PBS를 최종 부피 5ml에 추가합니다. 그런 다음 디스해리터, 원심분리기로 샘플을 기계적으로 균질화하고 섭씨 37도에서 콜라겐분해효소로 균질화된 조직을 분해합니다.
한 시간 후, 세포를 원심 분리하여 펠릿을 10ml의 완전한 배지에 재현탁시킵니다. 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 여과하고 세포를 다시 스핀다운하여 이번에는 5ml의 ACK에 펠릿을 재현탁합니다.
실온에서 5분 후 원심분리로 적혈구 용해 완충액을 제거하고 암 줄기세포 배지에 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 젤라틴으로 코팅된 접시에 세포를 섭씨 37도에서 배양하여 빠르게 부착되는 섬유아세포 대부분을 제거합니다. 1시간 후 상층액을 회수하고 생존 가능한 췌장암 세포의 수를 정량화합니다.