Sphere Formation Assay: 췌장암 줄기세포 및 스크리닝 요법을 확인하기 위한 In Vitro 방법

- 췌관 선암종(PDAC)은 독점적으로 종양형성 암 줄기세포(CSC)의 하위 집합을 포함합니다. CSC는 자가 재생이 가능하고 만능이며 종양을 형성할 수 있습니다. 그들은 항 세포 사멸 단백질을 발현하고 또한 다제 내성 유전자를 포함하여, 화학 요법에 내성을 갖는다. 암 줄기세포를 확인하고 약물이 줄기세포에 미치는 영향을 연구하기 위해 구체 형성 분석을 수행합니다.

먼저, 추출된 암 줄기세포를 원하는 세포 배양 배지에 현탁시킵니다. 다음으로, 세포 현탁액을 멀티웰 플레이트에 파종하고 원하는 기간 동안 배양합니다. 필요한 양의 관심 약물을 몇 개의 웰에 추가하고 다른 웰에 위약을 음성 대조군으로 추가합니다. 원하는 기간 동안 세포를 배양합니다. 암 줄기세포는 비부착성 배양 환경에서 구 모양의 군체를 형성합니다.

배양 후, 소량의 세포 현탁액을 혈구계에 피펫으로 주입하고 자동 세포 계수기에 넣습니다. 이제 형성된 구체의 수를 세십시오. 약물 처리된 세포는 일반적으로 구체의 크기와 수가 크게 감소합니다. 다음 프로토콜에서는 췌장암 줄기세포를 확인하고 메트포르민의 효과를 평가하기 위한 구 형성 분석을 수행합니다.

- 암 줄기세포 농축을 위한 종양구 형성을 촉진하기 위해 암 줄기세포 배지의 적정량에 세포를 2 곱하기 10의 최종 농도로 10배, 1밀리리터당 3개의 세포로 희석한 후 얼음에서 몇 분 동안 냉각시킵니다. 그런 다음 24개의 초저 부착 세포 플레이트의 첫 번째 및 마지막 열에 500마이크로리터의 PBS를 첨가한 후 피펫으로 세포를 재현탁하고 플레이트의 빈 웰에 웰당 1ml의 세포를 파종합니다.

4개의 세포 웰을 관심 약물로 처리하고 최소 4개의 음성 대조군 웰을 비히클로 처리합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 세포를 일주일 동안 배양합니다. 격일로 각 우물에 새로운 치료제나 차량을 추가하십시오.

5일 또는 7일째에는 더 큰 구조를 식별할 수 있는 자동화된 세포 계수기로 형성된 종양 구체의 수를 평가합니다. 종양 구체의 연속 전달을 위해 7일째에 40마이크로미터 세포 여과기를 사용하여 구체를 수확합니다. 다음으로, 구체를 스핀다운하고 섭씨 37도에서 20분 동안 1ml의 트립신으로 배양하여 펠릿을 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 그런 다음 방금 시연한 것처럼 7일 동안 세포를 더 확장하십시오.