0 조회수 • 4:24 분 • April 30th, 2023
- 등뿌리 신경절(dorsal root ganglion, DRG)은 말초에서 중추신경계로 메시지를 전달하는 감각 뉴런입니다. 대조적으로, myenteric plexus neuron은 장의 연동 운동에 관여합니다.
췌장암과 같은 암 질환에서 이러한 뉴런은 형태학적으로나 기능적으로 변화합니다. 신경 세포의 형태 변화를 연구하기 위해, 라미닌 단백질이 사전 코팅된 커버슬립에 신경 세포를 파종하고 멀티웰 플레이트에 넣고 세포 위에 신경 기저 배지를 놓습니다.
라미닌 단백질은 신경돌기 성장을 촉진합니다. 세포를 밤새 배양합니다. 다음으로, 처음 3개의 웰에 췌장암 조직 추출물 배지를 추가하고 다음 3개의 웰에 건강한 췌장 조직 추출물 배지를 추가합니다. 플레이트를 배양합니다. 이제 뉴런에 결합하는 뉴런 특이적 항체 마커를 사용하여 면역조직화학적 염색을 수행합니다. 커버 슬립을 유리 슬라이드에 놓고 슬라이드를 도립 현미경 아래에 놓습니다. 소프트웨어를 사용하여 신경돌기 밀도를 측정합니다.
췌장암 조직 추출물에서 배양된 DRG 뉴런은 일반적으로 건강한 췌장 조직 추출물보다 신경돌기 밀도가 더 높습니다. 대조적으로, myenteric plexus neuron은 건강한 췌장 조직 추출물보다 더 긴 신경돌기를 형성합니다. 다음 프로토콜에서는 신생아 마우스의 DRG 및 myenteric plexus neuron에 대한 in vitro neuroplasticity assay를 수행합니다.
- 배양을 위해 세포를 준비하려면 혈구계를 사용하여 뉴런과 신경교세포의 총 수를 추정합니다. 그런 다음 24웰 플레이트에 13mm 사전 코팅된 커버슬립에 세포를 파종합니다. 사용되는 코팅은 실험 목적에 따라 다릅니다. 다음으로, 우물 위에 신경 기저 배지를 바르고 세포가 하룻밤 동안 우물에 부착되도록 합니다. 다음날, 조직 추출물 보충 배지 또는 세포주 상등액 보충 배지를 해동합니다.
다음으로, DRG에서 파종배지를 흡입하고 PBS로 매우 부드러운 세척을 선택적으로 수행합니다. 그런 다음, 조직 추출물이 보충된 배지 또는 세포주 상등액이 보충된 배지를 세포에 천천히 피펫팅하여 밀리리터당 100마이크로그램을 생성했습니다. 이제 조직 추출물 또는 세포주 상등액이 공급되는 배지에서 섭씨 37도에서 48시간 동안 세포를 성장시킵니다. 48시간 후, 배지를 흡인하고 면역 염색을 위해 4% 파라포름알데히드를 고정합니다.
이중 면역형광 염색의 경우 뉴런 특이적 및 신경교세포 특이적 마커를 사용합니다. 형태 측정의 경우 CCD 카메라가 장착된 도립광 현미경과 자동화 소프트웨어를 함께 사용하여 신경돌기 밀도를 측정합니다. 200X 배율을 사용하여 50 X 50 미크론 그리드를 오버레이하고 교차하는 섬유에서 측정된 제곱당 섬유 밀도를 계산하여 신경 배양의 신경돌기 밀도를 측정합니다. 각 커버슬립에 있는 4-5개의 대표적인 현미경 사진에서 가장 밀집된 성장 영역 4개에 대해 이 분석을 반복합니다.
신경돌기와 주위돌기를 표시하여 각 커버슬립에서 무작위로 선택된 30개의 단독 뉴런에서 신경돌기 성장, 뉴런당 평균 가지 수, 평균 가지 길이 및 주위 크기를 측정합니다.