PTM 기반 종양 미세환경 모니터링: 종양 스페로이드를 사용하여 ECM 강성의 변화를 추적하는 방법

- 종양 침습에서 말초 종양 세포는 상피에서 중간엽으로의 전이 또는 EMT를 겪어 세포외 기질 또는 ECM의 국소 분해를 초래합니다. 종양 세포와 ECM의 in vitro 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

이러한 상호 작용을 연구하기 위해 췌장 종양 세포에서 유래한 사전 형성된 스페로이드를 내장된 형광 추적 프로브 및 배양 배지와 함께 콜라겐 스캐폴드가 포함된 플레이트로 옮깁니다. 종양 스페로이드는 프로테아제를 방출하여 콜라겐을 분해하고 ECM 강성을 감소시켜 ECM에서 추적 프로브가 자유롭게 이동할 수 있도록 합니다.

원하는 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 광학 현미경으로 샘플을 관찰하여 콜라겐 스캐폴드에 있는 샘플 포인트의 그리드를 보고 비디오 데이터를 기록합니다. 스페로이드 근처의 매트릭스 영역은 최대 콜라겐 분해를 보여줍니다. 따라서 프로브 모션이 증가했습니다. 대조적으로, 스페로이드에서 멀리 떨어진 영역은 콜라겐 분해가 적어 프로브 분자의 움직임이 제한됩니다.

추적 입자의 궤적을 측정하여 ECM의 유변학적 특성을 검사하는 이 기술을 입자 추적 미세유변학(PTM)이라고 합니다. 다음 프로토콜에서는 췌장암 줄기세포를 확인하고 메트포르민의 효과를 평가하기 위한 구 형성 분석을 수행합니다.

먼저 2개의 2ml 바이알이 있는 층류 후드 내부에 워크스테이션을 준비합니다. 바이알 1에는 종양 스페로이드가 포함되고 바이알 2에는 무세포 대조군이 포함됩니다. 25:25의 멸균수에 2:1의 스톡 프로브를 추가하여 카르복실레이트 변형, 1미크론 직경의 형광 추적 프로브의 희석된 혼합물을 준비합니다.

냉장고에서 밀리리터당 3.1밀리그램의 소 콜라겐 한 병을 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. 125마이크로리터의 콜라겐을 분취한 후 50마이크로리터의 희석된 추적 프로브 용액을 바이알 1에 넣습니다. Vortex를 잠시 사용하여 프로브를 배포합니다.

그런 다음 총 부피 410마이크로리터에 페놀 레드를 포함하는 적절한 세포 배양 배지 235마이크로리터를 추가하고 205마이크로리터를 제거하고 바이알 2에 넣기 전에 잠시 와류를 일으킵니다. 다음으로, 약 2마이크로리터의 1몰 수산화나트륨을 바이알 1에 첨가하여 용액을 중성 pH로 되돌립니다. 소용돌이를 간단히 섞습니다. 그런 다음 혼합물이 경화되지 않도록 즉시 얼음 선반으로 돌아가십시오.

종양 스페로이드가 들어 있는 웰에서 40마이크로리터의 배지를 부드럽게 제거합니다. 다음 단계를 수행하는 동안 이 40마이크로리터를 유지하십시오. 이전 단계에서 스페로이드가 제거되었는지 웰을 확인합니다. 그렇지 않은 경우 40마이크로리터를 우물에 다시 넣고 이전 단계를 반복합니다.

그렇다면 스페로이드가 포함된 40마이크로리터를 바이알 1에 추가합니다. 60마이크로리터 부분의 혼합물을 96웰 플레이트의 세 개의 별도 웰로 옮기기 전에 바이알 1을 부드럽게 저어줍니다. 혼합물을 첨가한 후 현미경으로 각 웰을 검사하여 어떤 웰에 스페로이드가 포함되어 있는지 확인합니다.

그런 다음 약 2마이크로리터의 1몰 수산화나트륨과 40마이크로리터의 세포 배양 배지를 바이알 2에 첨가하고 이 혼합물 60마이크로리터를 96웰 플레이트의 빈 웰에 분취하고 무세포 대조군으로 라벨링하기 전에 와류를 첨가합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣어 최소 1시간 동안 경화시킵니다.

샘플 포인트의 그리드를 구성하려면 먼저 인큐베이터에서 현미경 스테이지로 샘플 플레이트를 옮깁니다. 10분 동안 허용amp가열된 경우 s가 실온과 평형을 이룹니다.tage를 사용할 수 없습니다. 저전력 대물 렌즈로 샘플을 관찰하여 손상되지 않고 이미징할 준비가 되었는지 확인합니다. 웰 내의 종양 위치를 결정하고 후속 공간 공동 정합을 위해 투과광 이미지로 이를 문서화합니다.

일반적으로 스페로이드 주위의 동심원 고리에 분포된 각 웰에 있는 20개의 샘플 포인트는 적절하게 상세한 결과를 생성합니다. 스테이지를 원하는 각 위치로 이동하고 현미경 인터페이스 소프트웨어를 사용하여 x 및 y 좌표를 기록합니다.

현미경을 고출력 대물 렌즈로 전환하고 추적 프로브의 여기 파장에 적합한 필터 큐브를 선택합니다. 생성된 점 목록을 사용하여 그리드의 첫 번째 점으로 이동합니다. 위로 이동하여 여러 초점이 맞는 추적기 프로브가 포함된 시야를 찾기 전에 우물의 바닥을 찾기 위해 초점을 조정합니다.

강도 히스토그램을 관찰하고 노출 강도와 시간을 조정하여 이미지가 포화되지 않도록 하면서 가능한 최대 동적 범위를 제공합니다. 프레임당 20-30밀리초의 프레임 속도로 비디오 시퀀스를 얻고 적절한 명명 규칙을 사용하여 저장합니다. 녹음하는 동안 현미경이나 테이블을 만지지 마십시오.

그리드의 각 샘플 점에 대해 기록을 반복합니다. 그런 다음 프로세스를 반복하여 실험의 각 유정에 대한 그리드를 구성하고 종단 모니터링 기간 동안 각 시점에 대해 전체 프로세스를 반복합니다.

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