DNA 손상 병소 평가: 면역형광 염색을 사용하여 암 세포주에서 방사선 유도 DNA 손상 병소 식별

- 전리 방사선은 단일 가닥 절단(SSB) 및 이중 가닥 절단(DSB)과 같은 다양한 유형의 DNA 손상을 유발합니다. 단일 가닥 절단(SSB)은 방사선이 염기를 손상시키고 DNA 골격을 절단할 때 발생하며, 이중 가닥 절단(이중 가닥 절단, DSB)은 두 개의 SSB가 반대쪽 DNA 가닥에서 발생할 때 발생합니다. DSB 형성의 첫 번째 단계는 H2AX 히스톤의 인산화이며, 이는 면역형광 염색으로 시각화할 수 있습니다.

면역형광 염색을 수행하려면 페트리 접시에 놓인 커버 슬립에 고정된 샘플에 1차 항체를 추가합니다. 항체는 인산화된 히스톤 단백질 gamma-H2AX에 결합합니다. 샘플을 배양하고 PBS로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 다음으로, 1차 항체를 인식하고 결합하는 형광단을 운반하는 2차 항체를 추가합니다. 핵을 역염색하기 위해 원하는 양의 DAPI 형광 염색을 추가합니다.

커버 슬립을 장착 매체가 있는 유리 슬라이드에 부드럽게 장착하고 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. gamma-H2AX foci는 방사선 조사된 암세포에서 뚜렷한 형광 점으로 나타납니다. 다음 프로토콜에서는 방사선 조사된 인간 대장암 세포주에 대한 면역형광 염색을 수행하여 방사선 유도 DNA 복구 병소를 확인합니다.

- 조사 후 부착 된 세포에서 배지를 제거하고 PBS 2.5ml로 한 번 씻습니다. 그런 다음 1ml의 70% 에탄올로 10분 동안 세포를 고정합니다. 세포를 투과시키려면 에탄올을 제거하고 2.5ml의 PBS로 세척하십시오. PBS에 0.2% Triton X-100 1ml를 부드럽게 첨가하여 커버 슬립을 덮고 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다. PBS로 세포를 3회 세척하고 PBS에 희석한 2% BSA 1ml로 투과화를 차단합니다. 그런 다음 2% BSA로 최소 30분 동안 세포를 배양합니다. 세포를 염색하기 위해, PBS에 희석된 1차 항체를 텍스트 원고에서 권장하는 대로 BSA와 함께 적당량으로 첨가합니다. 그런 다음 페트리 접시를 덮고 습도를 유지하기 위해 촉촉한 리그닌이 있는 플라스틱 상자에 넣습니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

배양 후 PBS로 3회 세척하고 적당량의 2차 항체를 첨가합니다. 촉촉한 리그닌이 든 접시를 플라스틱 상자에 다시 넣고 섭씨 30도에서 최소 37분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 세척을 반복하고 최종 농도 100마이크로리터로 희석된 DAPI 1마이크