0 조회수 • 3:50 분 • April 30th, 2023
- 활성 산소 종은 전자가 전자 수송계에서 누출될 때 주로 미토콘드리아에서 생성됩니다. 이러한 전자는 분자 산소와 결합하여 다양한 활성 산소 종(ROS)을 생성합니다. 암세포에서는 활성 산소 종의 과잉 생산이 있습니다. 이러한 반응성이 높은 ROS 분자는 세포 내부의 막, 단백질 및 DNA를 산화적으로 손상시킬 수 있습니다.
ROS 수치가 증가하면 DNA가 손상되어 암 진행을 유발하는 발암 신호 전달 경로가 활성화됩니다. 따라서 암세포가 생성하는 활성산소종의 수치를 감지하는 것이 중요합니다.
적절한 배양 배지에서 인간 결장직장암의 암세포를 채취하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 이 세포를 멀티웰 플레이트에 시딩하고 DCFH-DA 용액을 추가합니다. 원하는 기간 동안 플레이트를 배양합니다. DCFH-DA는 세포막을 교차합니다. 일단 세포 내부로 들어가면, DCFH-DA는 세포 에스테라제 효소가 존재할 때 DCFH로 전환됩니다. 또한, 반응성 산소 종에 의한 DCFH의 산화는 녹색 형광 분자를 생성합니다.
형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 녹색 형광의 강도는 세포 내 활성 산소 종의 수준을 나타냅니다. 다음 프로토콜에서는 DCFH-DA 염료를 사용하여 결장직장암 세포의 활성 산소 종을 염색합니다.
- 세포를 염색하려면 약물 함유 배지를 제거하고 DMEM으로 한 번 세척하십시오. 각 웰에 500마이크로리터의 DCFH-DA 작업 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 우물에서 DCFH-DA를 제거하고 DMEM으로 두 번, PBS로 한 번 세척합니다.
그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 형광 현미경의 녹색 형광 단백질 채널을 사용하여 세포의 대표 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 각 웰에 200마이크로리터의 방사성 면역침전 분석 버퍼를 추가합니다.
플레이트를 얼음 위에서 5분 동안 배양하고 세포 용해물을 1.5ml 튜브에 모읍니다. 튜브를 21,130 x g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 상등액을 검은색 96웰 플레이트로 옮깁니다. 여기 파장이 485나노미터이고 방출 파장이 530나노미터인 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 형광을 측정합니다.
다음으로, 100마이크로리터의 단백질 분석 용액이 있는 투명한 96웰 플레이트에 상등액 1마이크로리터를 전달하여 Bradford 분석으로 단백질 농도를 측정합니다. 단백질 농도를 사용하여 형광 강도를 정상화합니다.