0 조회수 • 3:50 분 • April 30th, 2023
- 활성 산소 종은 전자가 전자 수송계에서 누출될 때 주로 미토콘드리아에서 생성됩니다. 이러한 전자는 분자 산소와 결합하여 다양한 활성 산소 종(ROS)을 생성합니다. 암세포에서는 활성 산소 종의 과잉 생산이 있습니다. 이러한 반응성이 높은 ROS 분자는 세포 내부의 막, 단백질 및 DNA를 산화적으로 손상시킬 수 있습니다.
ROS 수치가 증가하면 DNA가 손상되어 암 진행을 유발하는 발암 신호 전달 경로가 활성화됩니다. 따라서 암세포가 생성하는 활성산소종의 수치를 감지하는 것이 중요합니다.
적절한 배양 배지에서 인간 결장직장암의 암세포를 채취하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 이 세포를 멀티웰 플레이트에 시딩하고 DCFH-DA 용액을 추가합니다. 원하는 기간 동안 플레이트를 배양합니다. DCFH-DA는 세포막을 교차합니다. 일단 세포 내부로 들어가면, DCFH-DA는 세포 에스테라제 효소가 존재할 때 DCFH로 전환됩니다. 또한, 반응성 산소 종에 의한 DCFH의 산화는 녹색 형광 분자를 생성합니다.
형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 녹색 형광의 강도는 세포 내 활성 산소 종의 수준을 나타냅니다. 다음 프로토콜에서는 DCFH-DA 염료를 사용하여 결장직장암 세포의 활성 산소 종을 염색합니다.
- 세포를 염색하려면 약물 함유 배지를 제거하고 DMEM으로 한 번 세척하십시오. 각 웰에 500마이크로리터의 DCFH-DA 작업 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 우물에서 DCFH-DA를 제거하고 DMEM으로 두 번, PBS로 한 번 세척합니다.
그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 형광 현미경의 녹색 형광 단백질 채널을 사용하여 세포의 대표 이미지를 촬영합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 각 웰에 200마이크로리터의 방사성 면역침전 분석 버퍼를 추가합니다.
플레이트를 얼음 위에서 5분 동안 배양하고 세포 용해물을 1.5ml 튜브에 모읍니다. 튜브를 21,130 x g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 상등액을 검은색 96웰 플레이트로 옮깁니다. 여기 파장이 485나노미터이고 방출 파장이 530나노미터인 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 형광을 측정합니다.
다음으로, 100마이크로리터의 단백질 분석 용액이 있는 투명한 96웰 플레이트에 상등액 1마이크로리터를 전달하여 Bradford 분석으로 단백질 농도를 측정합니다. 단백질 농도를 사용하여 형광 강도를 정상화합니다.
본 연구에서는 대장암 세포에서의 활성 산소종(ROS) 생성을 조사하고, 암 진행 과정에서 ROS의 역할을 분석합니다. 실험 방법으로는 DCFH-DA를 이용해 암 세포를 염색한 후, 형광 현미경으로 ROS 수준을 측정하는 방식이 사용되었습니다.
대장암 세포주에서 총 활성산소종(ROS)을 정량적으로 검출함으로써 종양학 연구의 기전적 위험 제거 및 표적 검증이 가능해집니다. DCFH-DA 염색 워크플로우는 표준화되고 재현 가능한 ROS 측정을 제공하여, 초기 단계의 암 생물학 프로그램에서 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이러한 역량은 산화 스트레스를 발암 신호 전달 및 질병 진행과 연결함으로써 포트폴리오 분류 및 우선순위 결정에 정보를 제공합니다.
DCFH-DA ROS 검출 분석법은 발견 단계부터 전임상 단계까지의 연속 과정에 통합되어, 암세포 모델에서 강력한 가설 검증과 정량적 경로 분석을 가능하게 합니다.
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
관련 동영상
0 조회수
마지막 업데이트: 29 8월 2026