대변 미생물 DNA 분리: 쥐 종양 모델의 미생물 군집 다양성에 대한 환경 풍부화의 영향 연구

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- 환경 풍부화(Environmental enrichment, EE)는 암과 같은 다양한 질병에 유익한 효과를 얻기 위해 주거 매개변수를 수정하는 것을 말합니다. 종양이 있는 마우스에서 EE는 면역 체계를 활성화하고 염증을 줄여 궁극적으로 장내 미생물군을 개선하고 생존율을 향상시킵니다. 장내 미생물총(microbiota)의 변화를 연구하려면 쥐 대변이 들어 있는 튜브에 원하는 양의 대변 용해 완충액을 추가합니다.

샘플을 원심분리하고 상등액을 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. DNase 및 RNase를 변성시키는 guanidinium chloride lysis buffer를 추가합니다. 다음으로, 에탄올을 추가하고 샘플을 실리카 스핀 컬럼으로 옮깁니다.

에탄올은 DNA가 실리카에 결합하는 데 도움이 됩니다. 샘플을 원심분리합니다. 이제 컬럼을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 컬럼에 용리 완충액을 추가하여 DNA를 용리합니다.

샘플을 원심분리하고 컬럼을 폐기합니다. 샘플을 PCR 튜브로 옮기고 PCR을 실행하여 DNA를 증폭합니다. 아가로스 겔에 DNA를 로드하고 전기영동을 수행하여 미생물 DNA의 크기를 정량화합니다. 다음 프로토콜에서는 대변에서 DNA를 분리하여 종양 유발 마우스의 대장 미생물총(colon microbiota)에 대한 EE 효과를 분석합니다.

- 대변 병원체 검출 프로토콜에 따라 대변에서 미생물 DNA를 분리하기 위해 상용 키트를 활용합니다. 이때 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 샘플을 드라이아이스에 옮겨 무게를 잰다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 미생물 DNA를 증폭하는 PCR을 설정합니다. 그런 다음 마그네틱 비드를 사용하여 반응 생성물을 청소합니다.

세척을 위해 먼저 앰플리콘 PCR 플레이트를 간단히 원심분리하여 반응 산물을 당겨냅니다. 다음으로, 자기 비드를 와류로 둘러싸서 고르게 분산시키고 20 마이크로 리터의 분취액을 각 반응 웰로 전달합니다. 전체 부피를 천천히 10회 피펫팅하여 비드와 용액을 철저히 혼합합니다. 그런 다음 구슬이 5분 동안 가라앉도록 합니다.

다음으로, PCR 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓고 비드의 마그네틱 컬렉션 후 상층액이 제거될 때까지 2분 동안 기다립니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 다음으로, 플레이트를 자석에 그대로 놓고 각 비드 웰에 200마이크로리터의 신선한 80% 에탄올을 채우고 30초 동안 기다립니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.

이 세척 단계를 한 번 반복하고 비드를 10분 동안 자연 건조시킵니다. 이제 마그네틱 스탠드에서 플레이트를 제거하고 각 웰에 52.5마이크로리터의 Tris를 추가하여 비드에서 반응 생성물을 용리합니다. 전체 부피를 천천히 10회 피펫팅하여 비드를 용액에 완전히 혼합합니다. 그런 다음 이전과 같이 마그네틱 스탠드에 비드를 모으고 50마이크로리터의 상등액을 깨끗한 PCR 플레이트에 옮깁니다. 투명한 접착제로 접시를 덮고 최대 1주일 동안 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

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Last updated: 18 July 2026