0 조회수 • 4:55 분 • April 30th, 2023
- 오가노이드(organoid)는 3차원 체외 세포 구조로, 기원 기관의 주요 조직 특성을 모방하기 위해 자체 조직화됩니다. 라벨링을 시작하려면 수확된 오가노이드를 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 칵테일로 처리하여 세포를 현탁액으로 해리합니다. 효소 함유 상등액에서 세포를 분리하기 위한 원심분리기. 상등액을 버리십시오. 렌티바이러스 벡터를 함유한 배지를 사용하여 세포 펠릿을 용해합니다. 이러한 재조합 바이러스는 녹색 형광 단백질 또는 GFP에 대한 암호화 서열을 운반합니다.
바이러스는 세포와 융합하여 세포의 유전 물질과 특정 바이러스 효소를 세포질로 방출합니다. 바이러스 역전사효소는 숙주의 핵으로 이동하는 상보적인 바이러스 DNA를 합성합니다. 바이러스 인테그라제는 GFP 염기서열을 포함하는 바이러스 DNA를 숙주 게놈에 통합하는 데 도움이 됩니다. 이러한 형질도입된 세포를 세포외 기질 또는 ECM 코팅된 배양 플레이트에서 성장시킵니다. 배지와 원심분리기를 흡인하여 부착되지 않은 세포를 수집합니다. 추가 ECM에서 셀을 다시 현탁시킵니다.
세포 생존력을 촉진하기 위해 부착 배양액에 현탁액을 오버레이합니다. 매트릭스가 응고되면 배양 배지를 추가하고 배양하여 오가노이드 형성을 촉진합니다. 형광 현미경으로 배양을 관찰합니다. 형질도입된 세포는 녹색 형광 단백질을 합성합니다. 이 세포에서 형성된 오가노이드는 GFP 양성을 나타냅니다. 다음 프로토콜은 환자 유래 대장암 오가노이드 세포로의 GFP 렌티바이러스 형질도입을 보여줍니다.
- 배양 7-10일 후, 멸균 세포 스크레이퍼로 오가노이드를 기계적으로 분리하고 오가노이드를 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 500마이크로리터의 PBS에 다시 부유시키고 또 다른 원심분리를 위해 부드럽게 두드립니다. 결장직장암 오가노이드를 해리하려면 500마이크로리터의 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소 용액을 튜브에 넣고 부드럽게 두드리면서 섞습니다.
실온에서 10분 후 1% FBS가 보충된 배지 500마이크로리터를 세포에 첨가하고 세포 현탁액을 매우 부드럽게 여러 번 피펫팅하여 오가노이드를 분해합니다.
- 계대 배양 중 human CRC 오가노이드를 부드럽게 피펫팅하는 것은 배양에서 온전한 스페로이드 형성을 유지하는 데 매우 중요합니다.
- 세포를 다시 원심분리하고 100마이크로리터의 5x GFP 렌티바이러스 스톡과 400마이크로리터의 신선한 대장암 오가노이드 배양 배지에 펠릿을 재현탁합니다.
- 특히 거의 100%에 가까운 감염 효율을 달성하기 위해서는 GFP 렌티바이러스의 높은 역가로 인간 CRC 오가노이드를 감염시키는 것이 필수적입니다.
- 각 튜브의 부피를 조정하여 중간 농도의 500 마이크로 리터 당 5 배 10에서 5 번째 해리 된 종양 세포를 달성하고, 시연 된 바와 같이 인공 세포 외 매트릭스 코팅 12 웰 플레이트의 각 웰에 500 마이크로 리터의 세포를 플레이트합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 18시간 후, 원심분리를 위해 부유 세포 함유 상층액을 개별 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 얼음 위의 튜브당 70마이크로리터의 인공 세포 외 기질에 펠릿을 재현탁합니다.
결장직장암 세포의 생존력을 높이려면 종양 세포를 함유한 인공 세포외 기질을 12웰 플레이트의 종양 오가노이드에 오버레이하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 30분 동안 놓습니다. 인공 세포외 기질 코팅이 응고되면 1% FCS가 보충된 1ml의 신선한 CRC 오가노이드 배양 배지를 배양액에 공급하고 세포를 3일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 그런 다음 형광 현미경 검사로 감염된 세포를 관찰하여 거의 100% GFP 양성을 확인하고 세포를 4-6일 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.