0 조회수 • 5:19 분 • April 30th, 2023
- 돌연변이가 발생하고자 하는 종양 억제 유전자 측면에 있는 LoxP 삽입물이라고 하는 특정 Cre-recombinase 효소 인식 서열을 운반하는 변형된 게놈을 가진 마취된 조건부 돌연변이 마우스를 취하는 것으로 시작합니다. 수술로 복강을 노출시킵니다. 원위 결장을 찾아 윗부분을 고정합니다. 의료용 튜브를 항문으로 삽입하고 원위 결장으로 전진시킵니다. 대장에 식염수를 씻어내어 배설물을 제거합니다. 튜브를 교체하십시오. 분할을 위해 결장의 아래쪽 영역을 고정합니다. 적절한 세포 해리 용액을 사용하여 세그먼트를 팽창시킵니다. 이것은 점막 장벽을 천공하고 장샘 세포의 접근성을 높입니다. 해리 용액을 플러시 아웃합니다.
다음으로, 아데노바이러스 현탁액을 결장 분절에 주입합니다. 이러한 조작된 바이러스 벡터는 Cre-recombinase 효소를 암호화합니다. 바이러스는 세포로 들어가 DNA를 핵으로 방출하고 효소를 발현합니다. 단백질은 숙주 게놈에서 LoxP 삽입물을 인식하고 부위 특이적 재조합을 촉매하여 종양 억제 유전자를 비활성화합니다. 이러한 기능 상실 돌연변이는 암 진행을 촉진합니다. 절개 부위를 봉합하고 마우스가 회복할 수 있도록 합니다. 고립된 결장직장 종양의 성장을 관찰하기 위해 모니터링합니다. 다음 프로토콜은 분절 아데노-크레 감염에 의한 대장암 마우스 모델 생성을 보여줍니다.
- 마취된 마우스를 누운 자세로 놓고 동물의 눈에 연고를 바르는 것으로 시작합니다. 마우스를 안전한 위치에 테이프로 붙인 다음 발가락을 꼬집어 적절한 수준의 진정 효과를 확인합니다. 하복부 피부를 약 15mm 정도 정중선으로 절개합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 복벽 근육 조직을 잡고 가위로 근육을 조심스럽게 절개하여 복강을 엽니다. 원위 결장을 확인한 후 항문에서 약 15mm 떨어진 곳에 있는 섬세한 클램프로 조직을 조심스럽게 조입니다.
다음으로, 유연한 테프론 튜브를 항문 방향으로 삽입하고 내강 폐색에 도달할 때까지 튜브를 조심스럽게 전진시키고 30게이지 캐뉼라로 튜브를 캐뉼레이트합니다. 표준 1ml 주사기를 캐뉼라에 연결하고 모든 배설물이 배출될 때까지 몇 밀리리터의 생리식염수로 결장을 씻어냅니다. 원위 결장이 비워지면 식염수를 새 테프론 튜브로 교체하고 두 번째 클램프를 사용하여 첫 번째 클램프에서 원위부 약 3mm의 결장을 폐색합니다.
30 게이지 캐뉼라가 장착된 두 번째 1ml 주사기를 사용하여 50-80마이크로리터의 0.25% 트립신-EDTA를 고정된 결장 세그먼트에 조심스럽게 주입합니다. 결장은 고정된 조직 분절을 천공하지 않고 점막 장벽을 파괴할 수 있을 만큼 충분히 팽창해야 합니다. 10분 후 말단 클램프를 제거합니다. 그런 다음 트립신 튜브를 제거하고 500마이크로리터의 생리식염수로 원위 결장을 씻어냅니다.
새 테프론 튜브를 삽입한 후 결장을 다시 고정하고 50-80마이크로리터의 아데노바이러스 용액으로 조직을 팽창시킵니다. 30분 후, 클램프와 튜브를 제거하고 6-0 빠르게 흡수되는 러닝 러닝 봉합사로 복벽을 닫습니다. 수술 상처 클립으로 피부를 닫고 완전히 회복 될 때까지 발열 패드에서 동물을 모니터링합니다.
대장내시경 검사를 통해 종양 성장을 모니터링하려면 마취된 종양 보유 동물을 누운 자세로 가열 패드에 놓고 내시경을 장관에 경항으로 삽입합니다. 결장을 팽창시키기 위해 시각적 통제하에 공기를 부드럽게 흡입합니다. 그런 다음 원위 결장에서 점막 병변이 식별될 때까지 내시경을 조심스럽게 앞으로 밀어 나중에 평가하기 위해 각 내시경 이미지를 획득할 때 저장합니다. 모든 이미지를 얻었으면 내시경을 천천히 제거하고 완전히 회복될 때까지 마우스를 섭씨 38도의 가열 패드에 올려 놓습니다.