CRC 세포의 포스파타아제 분석: 결장직장암 세포에서 타우 단백질의 인산화 상태를 검사하는 방법

- 타우 단백질은 결장직장암 세포의 핵소체(nucleolus)에 말초적으로 국한되어 있으며 핵암 구조를 유지하는 데 도움을 줍니다. 대부분 이러한 세포는 과인산화된 타우 단백질을 발현하여 약물 내성을 일으킵니다. 따라서 우리는 인산가수분해효소 분석을 수행하여 타우 인산화 수준을 분석합니다.

먼저 인간 결장직장암 세포의 총 단백질을 포함하는 세포 용해물을 test and control이라고 표시된 두 개의 바이알에 넣습니다. 테스트 샘플을 알칼리성 인산가수분해효소로 처리합니다. 알칼리성 인산가수분해효소는 타우에서 인산기를 제거하는 반면, 대조군 바이알은 인산화된 타우 단백질을 유지합니다.

다음으로, 샘플과 대조군 타우를 폴리아크릴아미드 겔에 모두 실행하여 단백질을 분리합니다. 인산화된 타우는 인산화되지 않은 타우 단백질보다 겔에서 느리게 움직입니다. 단백질 샘플을 적절한 멤브레인에 전기로 블롯팅하고 인산화 타우와 정상 타우 모두에 해당하는 1차 항체를 추가합니다.

밤새 블롯을 배양하십시오. 1차 항체의 Fc 영역에 결합하는 리포터 효소 접합 2차 항체로 블롯을 치료합니다. 마지막으로, 화학발광 기질을 사용하여 블롯을 현상하여 블롯에 존재하는 총 단백질 샘플에서 타우 단백질을 식별합니다. 다음 프로토콜에서는 CRC 세포에서 타우의 전반적인 인산화 상태를 평가하기 위한 인산가수분해효소 분석을 시연할 것입니다.

- 총 단백질 20 마이크로 그램을 함유 한 샘플을 준비 한 후, 2 마이크로 리터의 알칼리 인산 가수 분해 효소 완충액과 10 마이크로 리터의 알칼리 인산 가수 분해 효소를 각각 첨가합니다. 그런 다음 각 샘플의 최종 부피가 20마이크로리터가 되도록 증류수를 추가합니다.

샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플이 배양하는 동안 동일한 농도로 추가 샘플을 준비하되 비교를 위해 포스파타아제는 준비하지 않습니다. 1시간 후, 최종 농도 50 millimolar에서 EDTA를 첨가하거나 최종 농도 10 millimollar에서 sodium orthovanadate를 첨가하여 반응을 중지합니다.

400밀리몰 DTT를 함유한 갓 준비된 4X SDS 젤 로딩 버퍼를 추가합니다. 열 블록을 사용하여 섭씨 100도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 샘플을 볼텍스한 다음 실온에서 10-15분 동안 식힙니다.

다음으로, 웰당 13마이크로리터의 샘플과 10% 폴리아크릴아미드 겔에 분자량 래더를 로드합니다. 전기영동 시스템을 전원에 연결하고 전압을 20분 동안 70볼트로 설정하여 단백질 샘플을 스태킹 겔에서 분해 겔로 이동합니다.

그런 다음 125볼트로 높이고 샘플과 단백질 래더가 겔 끝에 도달할 때까지 약 70-120분 동안 겔을 실행합니다. 습식 전기블로팅 시스템을 사용하여 약 100분 동안 100볼트의 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인에 겔을 옮깁니다.

다음으로, 멤브레인을 배양하여 실온에서 90분 동안 4% 소 혈청 알부민을 블롯아웃시킵니다. 블롯을 섭씨 4도의 1차 항체 용액에서 밤새 배양합니다. 다음 날, PBST에서 얼룩을 세 번 씻고 매번 7 분 동안 씻습니다.

관련 2차 항체 용액을 실온에서 90분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST로 4회 세척하며 각 세척은 7분 동안 지속됩니다. 제조업체의 지침에 따라 화학발광 키트를 사용하여 블롯을 현상합니다.

현상된 블롯을 투명 플라스틱 랩으로 덮은 다음 시판되는 화학발광 이미징 시스템으로 블롯의 화학발광 이미지를 획득합니다.