CRC 세포의 미세소관 결합 분석: 결장직장암 세포의 미세소관 결합 타우 단백질을 검사하는 방법

- 타우(Tau)는 미세소관을 안정화하고 조립하는 데 관여하는 미세소관 관련 단백질입니다. 많은 암세포는 과인산화된 타우 단백질을 발현하는데, 이 단백질은 잘 조직된 미세소관 결합을 유지하지 못합니다. 타우 단백질과 미세소관 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 타우 단백질과 미세소관 작업 용액을 포함하는 암세포 용해물을 마이크로분리 튜브에 추가합니다.

세포 용해물에 존재하는 비인산화된 타우 단백질은 미세소관에 결합합니다. 이제 튜브에 원하는 양의 PEM 완충액을 추가하여 필라멘트로 중합되어 미세소관을 형성하는 단백질인 튜불린의 활성을 안정화합니다. 원하는 기간 동안 혼합물을 배양합니다.

혼합물을 원심분리하여 미세소관 결합 단백질을 펠릿화합니다. 결합되지 않은 단백질은 상층액에 남아 있습니다. 상층액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 적절한 완충액에 다시 현탁시킵니다. 다시 현탁된 펠릿 현탁액에 겔 로딩 버퍼를 추가하고 폴리아크릴아미드 겔에서 샘플을 실행하여 적절한 멤브레인에서 미세소관 결합 단백질과 전기블롯을 분리합니다.

적합한 항체를 추가하고 화학발광 기질을 사용하여 블롯을 개발하여 결합된 타우 단백질을 식별합니다. 다음 프로토콜에서는 미세소관 결합 단백질을 식별하기 위해 미세소관 결합 분석을 수행합니다.

- 신선한 샘플을 준비한 후 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 100,000 x g 및 섭씨 25도에서 60분 동안 샘플을 초원심분리합니다. 다음으로, 결합되지 않은 타우를 포함하는 각 상등액 120마이크로리터를 깨끗하고 라벨링된 튜브를 분리하기 위해 옮깁니다. 결합된 tau가 포함된 펠릿에 120마이크로리터의 5X 샘플 버퍼를 추가합니다.

볼텍싱(vortexing)과 피펫팅(pipetting)으로 철저히 혼합한 후, 혼합물을 라벨이 부착된 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 동등한 단백질 농도의 샘플을 준비한 후 400밀리몰 DTT를 함유한 새로운 4X SDS 겔 로딩 버퍼를 추가합니다. 열 블록을 사용하여 섭씨 100도에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.

샘플을 와류로 만든 다음 실온에서 10-15분 동안 식히십시오. 웰당 13마이크로리터의 샘플과 분자량 래더를 10% 폴리아크릴아미드 겔에 로드합니다. 전기영동 시스템의 양극과 음극을 전원에 연결한 다음 전압을 70분 동안 20볼트로 설정합니다.

그런 다음 125볼트로 높이고 샘플과 단백질 래더가 겔 끝에 도달할 때까지 약 70-120분 동안 겔을 실행합니다. 습식 전기블로팅 시스템을 사용하여 약 100분 동안 100볼트의 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인에 겔을 전사합니다. 멤브레인을 배양하여 실온에서 90분 동안 4% 소 혈청 알부민을 블롯아웃시킵니다. 그런 다음 섭씨 4도의 1차 항체 용액에서 밤새 배양합니다.

다음 날, PBST로 얼룩을 4번 씻고 각 세척은 7분 동안 지속됩니다. 세척된 블롯을 관련 2차 항체 용액에 넣고 실온에서 90분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST로 7분 동안 세척하고 총 4회 세척을 반복합니다. 화학발광 키트를 사용하여 블롯을 현상합니다. 투명 플라스틱 랩으로 덮고 화학발광 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 획득합니다.