전혈 샘플에서 CTC 분리: 쥐 대장암 모델에서 CTC를 얻는 방법

0 조회수3:50 • April 30th, 2023

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- 순환 종양 세포(Circulating Tumor Cells, CTC)는 원발성 종양에서 유래하여 혈액 순환으로 들어가는 암세포입니다. 대부분의 CTC는 표면에 부착되지 않고 혈류에서 생존할 수 있습니다. 따라서 대부분의 암 환자의 혈액에서 직접 검출할 수 있습니다.

혈액 내 CTC는 종양이 체내로 퍼져 있음을 나타낼 수 있으므로 이를 식별하는 것은 암 진행을 이해하는 데 도움이 됩니다. 마취된 대장암 마우스 모델을 채취하여 심장 천자로 혈액을 채취하는 것으로 시작합니다. 혈액을 밀도 구배 매체와 원심 분리기를 포함하는 원뿔형 튜브로 옮겨 혈액 성분을 분리합니다.

혈장이 포함된 최상층을 버리고 계면에 존재하는 말초 혈액 단핵 세포 분획(PBMC)을 별도의 튜브에 수집합니다. 다음으로, PBMC 세포에 항-EpCAM 항체를 추가하고 형광 현미경으로 관찰합니다. 순환 CTC는 EpCAM(EpCAM)으로 알려진 세포 마커를 발현합니다. 따라서 항 EpCAM 항체는 EpCAM 양성 CTC를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

CTC를 수집하고 추가 다운스트림 분석을 위해 저장합니다. 다음 프로토콜에서는 대장암 마우스 모델의 말초 단핵 세포 혈액 분획에서 EpCAM 발현 CTC를 확인할 것입니다.

- 적절한 실험 종점에서 순환 종양 세포를 분리하려면 15ml 원뿔형 튜브를 튜브당 5ml의 밀도 구배 매체로 채우고 종양 보유 동물에서 수집한 전혈 샘플을 밀도 구배층으로 조심스럽게 옮깁니다.

원심분리로 세포를 분리하고 단핵 세포를 포함하는 계면을 조심스럽게 회수합니다. 두 번째 원심분리를 위해 단핵 세포를 새로운 15ml 튜브에 피펫팅한 다음 PBS를 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 EDTA가 보충된 200마이크로리터의 PBS에 펠릿을 재현탁시키고 각 샘플에 4마이크로리터의 항-EpCAM 항체를 추가하여 어둠 속에서 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다.

다음으로, 소수성 배리어 펜을 사용하여 샘플당 1개의 멸균 6cm 페트리 접시에 약 1cm의 원을 그리고, 각 원에 700마이크로리터의 피킹 버퍼를 추가한 다음 50마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 현미경을 사용하여 세포의 밀도를 확인하고 샘플이 약 5분 동안 가라앉도록 합니다. 그런 다음 세포 방울에서 EpCAM 양성을 스크리닝하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 관심 세포를 의도된 후속 다운스트림 분석을 위한 적절한 완충액 50마이크로리터로 이동합니다.

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마지막 업데이트: 22 8월 2026