Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: 기질의 세포 접착 및 확산을 연구하기 위한 면역형광 기반 방법

- 기질 형태는 암세포의 행동과 전이 반응에 큰 영향을 미칩니다. 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)의 동적 네트워크는 세포에 구조적 지지를 제공하고 세포 이동을 매개합니다. 국소 접착(focal adhesion)이라고 하는 큰 막 관련 단백질 복합체는 세포골격과 세포외 기질을 연결하여 세포 확산을 촉진합니다.

염색을 시작하려면 암세포 배양물을 채취하고 파라포름알데히드로 처리하여 세포를 고정하고 투과화합니다. 이제 단백질이 포함된 신호 인핸서 시약으로 세포를 배양하여 세포가 배경 염색을 줄일 수 있도록 준비합니다. 국소 접착 복합체 내의 단백질 중 하나인 빈쿨린에 결합하는 항 빈쿨린 1차 항체를 추가합니다.

다음으로, 1차 항체를 표적으로 하는 형광 염료 접합 2차 항체로 샘플을 배양합니다. 마지막으로, 세포골격의 액틴 필라멘트에 선택적으로 결합하는 형광 태그가 지정된 팔로이딘 접합체로 세포를 처리합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 세포를 관찰하여 형광 신호를 연구합니다.

형태학이 잘 퍼진 세포는 정의된 액틴 섬유를 나타내며 뚜렷하고 길쭉한 빈큘린 함유 국소 접착을 나타냅니다. 반대로, 잘 퍼지지 않은 세포는 정의된 액틴 필라멘트를 가지고 있지 않지만 반점 빈큘린을 함유한 국소 접착을 나타냅니다. 다음 프로토콜에서는 원발성 대장암 세포의 세포골격 및 국소 접착 조직을 연구하기 위한 면역형광 분석을 시연할 것입니다.

- 면역 염색 할 기질을 층류 후드로 가져 와서 배양 배지를 제거하십시오. 그런 다음 인산염 완충 식염수(PBS)로 기질을 헹구고 PBS에 4% 파라포름알데히드로 세포를 실온에서 20분 동안 고정합니다. PBS로 기질을 5분 동안 총 3회 세척합니다. 그런 다음 PBS로 헹구기 전에 30분 동안 500마이크로리터의 신호 인핸서로 기판을 배양합니다.

다음으로, PBS에 1 내지 250 희석하여 단클론 항빈쿨린 항체를 실온에서 45분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 PBS로 기질을 5분 동안 총 3회 세척합니다. 2차 항체 Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG를 PBS에서 1-200 희석하여 실온에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 PBS로 기질을 다시 5분 동안 총 3회 세척합니다.

F-액틴 구조를 시각화하기 위해 테트라메틸로다민-팔로이딘 접합체를 실온에서 45분 동안 밀리리터당 50마이크로리터 농도로 세포를 배양합니다. 그런 다음 이전과 같이 기판을 다시 세척하십시오. 마지막으로, 컨포칼 스캐닝 레이저 현미경을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.

• Focal Adhesion - Protein complex facilitating cell-cytoskeleton and extracellular matrix connection.
• Vinculin - An integral protein within the focal adhesion complex.
• Actin Cytoskeleton - Provides structural support to cells and mediates cellular movement.
• Immunofluorescence - A staining method used to visualize components within a cell.
• Cell Spreading - The process related to cell movement and attachment involving focal adhesions and actin filaments.

• Introduce Focal Adhesion - Protein complex connecting actin cytoskeleton and extracellular matrix (e.g., vinculin).
• Key Concepts - Supporting cell's structural integrity, movement, and interactions (e.g., actin network).
• Underlying Mechanisms - Fundamental processes facilitating cell adhesion, spreading, and movement.
• Connect to Experiment - Using immunofluorescence to visualize actin and vinculin in cancer cells.

• What is focal adhesion and how does it facilitate cellular movement and interaction?
• How does vinculin function within the focal adhesion complex?
• How is immunofluorescence used to study the organization of actin cytoskeleton and focal adhesion?

• Practical Applications – Understanding cellular behavior and responses through immunofluorescence (e.g., cancer research).
• Industry Impact – Enhancing the understanding of cell morphology in biomedical sector (e.g., drug development).
• Societal Importance – Broadening comprehension of diseases trajectory and treatment options (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements - Immunofluorescence marks a significant advancement in cell biology studies.