0 조회수 • 4:23 분 • April 30th, 2023
- 정지된 멜라닌 세포 줄기 세포는 자외선 또는 모발 제모에 반응하여 활성화됩니다. 활성화된 흑색종 줄기세포는 피부암의 한 형태인 피부 흑색종을 유발할 수 있습니다. 흑색종을 연구하기 위해 우리는 고정 절차 중에 DNA와 단백질의 원래 구조를 유지하기 위해 냉동 피부 조직 블록을 준비합니다.
먼저 안락사된 흑색종 쥐를 수술 침대에 눕히고 꼬리 위 피부의 등쪽 부위에서 털을 제거합니다. 피부를 절제하고 여과지로 덮습니다. 다음으로, 피부 조직을 포함하는 여과지를 원하는 시간 동안 중성 완충 포르말린에 담그십시오. 포르말린은 피부 조직에 침투하여 아미노산에 결합하여 단백질의 가교를 일으켜 조직 고정을 유발합니다.
종이에서 피부 조직을 제거하고 조직을 잘라 원하는 크기의 조각을 얻습니다. 이제 OCT 매체로 채워진 극저온 몰드에 조직 조각을 수직으로 삽입하고 드라이 아이스에 냉동 몰드를 놓습니다. OCT는 동결 시 응고되어 조직 표본 주위에 젤라틴 층을 형성하여 제자리에 고정하는 표본 매트릭스입니다. 추가 조직학적 분석을 위해 동결 블록을 사용하십시오. 다음 프로토콜에서는 피부 흑색종을 연구하기 위해 쥐 등쪽 피부에서 동결된 피부 조직 블록을 준비할 것입니다.
- 피부 샘플을 분리하려면 전기 트리머를 사용하여 안락사된 방사선 조사된 마우스의 등 피부 부위에서 털을 제거하고 보푸라기가 없는 조직으로 노출된 피부를 가볍게 솔질하여 해당 부위를 청소합니다. 꼬리 아랫부분 바로 위에 날카로운 가위로 작게 절개하고 절개 부위에 크고 뭉툭한 가위를 삽입하여 피하 결합 조직을 분리합니다. 날카로운 가위를 사용하여 관심 피부 부위의 가장자리를 따라 조심스럽게 잘라 조직 샘플을 분리하고 절제된 피부 조직을 깨끗한 종이 타월에 놓습니다.
그런 다음 무딘 집게를 사용하여 피부가 수건에 밀착되어 팽팽하게 당겨지도록 합니다. 모든 샘플을 채취한 후 피부 샘플과 종이 타월 뒷면을 주름 바로 옆에 접힌 여과지 조각에 넣고 샘플이 매끄럽고 접히거나 구겨지지 않도록 주의합니다. 스테이플로 여과지의 측면을 닫고 용지를 자릅니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 3-5시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 완전히 담근 후 탈이온수로 5분 동안 두 번 세척하여 조직을 세척합니다.
두 번째 세척 후 피부 조직에서 잔류 물질을 조심스럽게 제거하고 샘플의 가장자리가 들쭉날쭉하지 않도록 다듬습니다. 다음으로, 스트립의 너비가 5mm를 넘지 않도록 각 샘플에서 3개의 시상 절단을 만들고 샘플의 너비가 20mm를 넘지 않도록 가로 절단을 합니다. 최적의 절단 온도 또는 OCT 매체를 포함하는 크라이오몰드를 세로 방향으로 배치하고 OCT 위에 4-5개의 피부 조각을 놓습니다.
모든 조각이 제자리에 놓이면 두 쌍의 미세한 집게를 사용하여 각 피부 조각의 긴 가장자리를 cryomold의 바닥으로 가져와 샘플이 OCT 내에서 수직이 되고 금형 바닥에 수직이 되도록 합니다. 그런 다음 두 번째 립에 추가 OCT를 금형에 채우고 필요에 따라 블록이 얼기 시작할 때 이동 중에 이동했을 수 있는 피부 조각을 집게를 사용하여 드라이 아이스 조각의 평평한 표면에 금형을 놓습니다.