Name: 마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 마우스 배아 폐 분리 및 배양 기법을 통해 상피-중간엽 상호작용을 연구하는 방법입니다. FGF9 처리에 따른 성장 및 분기 변화를 관찰하여 폐 발달의 분자 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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이 작품은 Saban 연구소 사전 박사 수상 (PMDM)에서 지원하고, NIH RO1 HL75773 (DW)에 의해.했습니다

오르간 문화는 유전자와 단백질 발현을 연구하기 위해 매우 유용하고 다재 다능한 기술입니다. 이 전 생체내 문화 방법은 사전 또는 생체내 연구에 보완에 사용할 수 있습니다. 1. 배아 룽 절연 <ol><li> 시간 초과 - 임신 생쥐는 NIH와 OLAW 지침에 따라 CO 2 마취법에 의해 postcoitum 일 11.5 또는 12.5 (E11.5 - 12.5)에 희생됩니다. 동물은 챔버에 배치되며 100 % CO 2가 도입됩니다. 동물이 의식이 후 CO 2 흐름이 증가됩니다. 동물의 임상 죽음을 보장해야합니다. </li><li> 모든 다음 단계는 층류 후드에서 무균 조건 하에서 완료해야합니다. 자궁은 임신 여성에서 제거됩니다. 동물의 자궁을 제거하려면 임신 여성 자신의 뒤쪽에 위치하고 70 % 에탄올로 뿌렸 수 있습니다. 절개는 복부에 만들어이며, 피부는 동물의 뒷다리를 누른 상태에서 위쪽으로 피부를 당겨 제거됩니다. 복막 캐비티가 열립니다과 자궁은 동물에서 제거됩니다. </li><li> 혈액은 추운 행크스 밸런스드 소금 솔루션 (HBSS)으로 가득 50 ML 원뿔 관에 자궁을 배치 해제 씻어서이며, 튜브가 부드럽게 2 분 누볐어입니다. </li><li> 자궁은 다음 입체 해부 현미경 페트리 접시에 배치하고, 배아는 봄 가위를 사용하여 자궁 벽을 절개하여 자궁에서 발표됩니다. 배아는 천공 숟가락을 사용하여 수확하고, HBSS를 포함하는 새로운 배양 접시에 얼음에 표시됩니다. </li><li> 입체 해부 현미경, 배아 폐가 차가운 HBSS (그림 1)이있는 페트리 접시에 하나씩를 해부하고 있습니다. </li><li> 분리된 배아 허파는 살균 전송 피펫을 사용하여 HBSS를 포함하는 페트리 접시에 얼음에 위치합니다. </li></ol> 2. 배아 룽 문화 <ol><li> 1 밀리리터에 따라 잘 D-MEM/F-12 500 microliters의 페니실린 - 스트렙토 마이신의 50 단위 / ML과 보충은 Nunclon의 폴리스티렌 접시에 추가됩니다. </li><li> Nuclepore 폴리 카보 네이트 트랙 엣지 분리막은 미디어의 상단에 위치합니다. Nuclepore 폴리 카보 네이트 트랙 엣지 분리막은 미디어의 상단에 배치되면, 빛나는 측면은 미디어, 그리고 거친 면을 위쪽에 직면에 대해되어 있는지 확인합니다. </li><li> 해부 배아 폐암은 살균 전송 피펫을 사용하여 Nuclepore 폴리 카보 네이트 트랙 엣지 분리막 위에 위치합니다. </li><li> 배아 폐 위치는 포셉를 사용하여 조정됩니다. 필터에 위치 배아 허파가 손상 기관이 있어야하고 바로 입장을 가지고 그들의기도와 배치, 따라서 모든 폐 같은 내부 압력을 가지고 있도록합니다. </li><li> Nunclon의 폴리스티렌 요리는 세포 배양기 (그림 2)에서 원하는 문화 시간에 전송됩니다. </li></ol> 3. 자료 1. 배아 전체 룽 격리 <ol><li> 시간이 초과되었습니다 - 임신 (C57BL6 야생 입력하거나 유전자 변형) 생쥐 13.5 (E11.5 - 13.5)에 postcoitum 일 11.5에 희생 될 수 있습니다. </li><li> 염화칼슘, 염화 마그네슘 또는 마그네슘 황산없이 행크스 '밸런스드 소금 솔루션 (HBSS) (1X), 액체,. (Invitrogen, 칼스 배드, CA) 50 단위 / 페니실린 - 스트렙토 마이신의 ML (Invitrogen, 칼스 배드, CA)과 보완. 실온에서 4 ° C에서 개통 후 HBSS를 저장합니다. 나누어지는하고 보관 -20 ° C.에 페니실린 - 스트렙토 마이신 </li><li> 입체 해부 현미경 (Leica, Wetzlar, 독일). </li><li> 더몬트 포셉, 파인 이리스 가위 (직선), 노예스 봄 가위와 모리아 ® 스푼 (천공) (파인 과학 도구, 포스터 시티, CA)를 포함 해부로드 공구를 추천하십시오. </li></ol> 2. 배아 전체 룽 문화 <ol><li> 중간 Dulbecco의 수정된 이글 : 영양소 믹스 F - 12 (D-MEM/F-12) (1X), 액체, 1:1 L - 글루타민을 포함하지,하지만 HEPES 버퍼. (Invitrogen, 칼스 배드, CA) 50 단위 / 페니실린 - 스트렙토 마이신의 ML (Invitrogen, 칼스 배드, CA)과 보완. 4 DMEM/F-12 거리 조명 (예 : 알루미늄 호일에 포함)의 병 및 저장 ° C. 유지 나누어지는하고 보관 -20 ° C.에 페니실린 - 스트렙토 마이신 </li><li> Nuclepore 폴리 카보 네이트 트랙 엣지 분리막, 8.0 - M, 13mm (왓먼 Nuclepore 트랙 엣지 멤브레인 (왓먼, 플로럼 공원, NJ). </li><li> 뚜껑과 Nunclon의 폴리스티렌 요리, 4 우물 (로체스터, NY). </li><li> 일회용 전송 pipettes, 멸균 (피셔 과학, 피츠버그, PA). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. E12 배아 폐의 해부. (A) E12.5 전체 난자는 오른쪽에서 볼. (B)를 마우스 오른쪽 forelimb이 배아에서 제거되었습니다. (C) 집게는 접시에 안정적인 배아를 들고 왼손으로 개최. 화살표가 (D) 배아의 폐 마음 (제거하기 위해 사후 거짓말을 해부의 계획을 나타냅니다척추)과 앞쪽에. 이 그림은 피부와 심장 제거 후 폐를 보여줍니다. (E) 인두 제거는 배아의 손상 폐 분리 수 있습니다. (F) 외부 pharyngeal 조직과 식도가 떨어진 손질했습니다. 그대로 기관과 후두와 해부 E12.5 배아 폐암이 표시됩니다. (CR) 두개골 엽 (클럽메드) 중간 엽 (CA) 꼬리의 엽 (ACC) 액세서리 엽 (르) 왼쪽 엽. <img src="/files/ftp_upload/2035/2035fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. FGF9은 mesenchyme의 확장과 체외에서 성장 폐암에서 상피의 팽창을 유도. (AC) E12.5 폐가 FGF9의 부재에서 48 시간 동안 성장합니다. 분기의 증가에 유의하십시오. (DF) E12.5 폐는 FGF9의 존재에 48 시간 동안 성장. 문화 24 시간 후 빠르면 상피와 mesenchyme (E)의 팽창을 확인합니다. 48시간 (F) 후, 상피에 대한 효과는 더욱 발음입니다. 스케일 바 : AF 400 μm의 4. 이 실험 방법에 대한 전체 텍스트 프로토콜에서 사용할 수 있습니다 <a href="http://springerprotocols.com/Abstract/doi/10.1007/978-1-59745-019-5_5">스프링거 프로토콜</a> .

<ol><li>Alescio, T., Cassini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+in+vitro+of+tracheal+buds+by+pulmonary+mesenchyme+grafted+on+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Induction in vitro of tracheal buds by pulmonary mesenchyme grafted on tracheal epithelium.</a> J Exp Zool. 150, 83-94 (1962).</li>
<li>Warburton, D., Schwarz, M., Tefft, D., Flores-Delgado, G., Anderson, K. D., Cardoso, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+lung+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of lung morphogenesis.</a> Mech Dev. 92, 55-81 (2000).</li>
<li>Spooner, B. S., Hardman, P., Paulsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+in+mammalian+organ+development%3A+differentiation+of+cultured+lung+and+pancreas+rudiments+during+spaceflight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool%22%5BJournal%5D)">Gravity in mammalian organ development: differentiation of cultured lung and pancreas rudiments during spaceflight.</a> J Exp Zool. 269, 212-222 (1994).</li>
<li>Moral, del, M, P., De Langhe, S. P., Sala, F. G., Veltmaat, J. M., Tefft, D., Wang, K., Warburton, D., Bellusci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+role+of+FGF9+on+epithelium+and+mesenchyme+in+mouse+embryonic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential role of FGF9 on epithelium and mesenchyme in mouse embryonic lung.</a> Dev Biol. 293, 77-89 (2006).</li>
<li>Moral, D. el, M, P., Sala, F. G., Tefft, D., Shi, W., Keshet, E., Bellusci, S., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-A+signaling+through+Flk-1+is+a+critical+facilitator+of+early+embryonic+lung+epithelial+to+endothelial+crosstalk+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis.</a> Dev Biol. 290, 177-188 (2006).</li>
<li>Jaskoll, T. F., Don-Wheeler, G., Johnson, R., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+mouse+lung+morphogenesis+and+type+II+cytodifferentiation+in+serumless%2C+chemically+defined+medium+using+prolonged+in+vitro+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Embryonic mouse lung morphogenesis and type II cytodifferentiation in serumless, chemically defined medium using prolonged in vitro cultures.</a> Cell Differ. 24, 105-117 (1988).</li>
<li>Seth, R., Shum, L., Wu, F., Wuenschell, C., Hall, F. L., Slavkin, H. C., Warburton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epidermal+growth+factor+expression+in+early+mouse+embryo+lung+branching+morphogenesis+in+culture%3A+antisense+oligodeoxynucleotide+inhibitory+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of epidermal growth factor expression in early mouse embryo lung branching morphogenesis in culture: antisense oligodeoxynucleotide inhibitory strategy.</a> Dev Biol. 158, 555-559 (1993).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

마우스 배아의 폐 문화, 분기의 분자 메커니즘을 평가하는 시스템

Mouse Embryonic Lung Culture, A System to Evaluate the Molecular Mechanisms of Branching

폐 원시 사양뿐만 아니라 분기 morphogenesis, 다양한 폐 세포 lineages의 형성은 주변 mesenchyme과 mesothelium과 폐 endoderm의 특정 상호 작용을 필요로합니다. 폐 mesenchyme는 폐 분기 morphogenesis을위한 유도 신호의 소스로 표시되었습니다. 상피 - mesenchymal - mesothelial 상호 작용은 또한 배아 폐 morphogenesis에 중요합니다. 초기 배아 폐 기관의 문화는 상피 - mesenchymal 상호 작용을 연구하기 위해 매우 유용한 시스템입니다. 쉽게 (산모 영향과 혈액 흐름의 부재에서)이 시스템에서 조작할 수있는 구체적인 조건 하에서 상피와 mesenchymal 모두 morphogenesis 진행. 더 중요한 것은이 기술은 쉽게 serumless, 화학적으로 정의 문화 미디어로 이루어 질 수 있습니다. 함수의 이득과 손실 표현 단백질, 재조합 바이러스 벡터 및 / 또는 유전자 변형 마우스 변종, 안티 센스 RNA뿐만 아니라 RNA 간섭 유전자 최저 분석을 사용하여 얻을 수 있습니다.

초기 배아 폐 기관의 문화는 상피 - mesenchymal 상호 작용을 연구하기 위해 매우 유용한 시스템입니다. 쉽게이 시스템에서 조작할 수있는 구체적인 조건 하에서 상피와 mesenchymal 모두 morphogenesis 진행.

폐 원시 분화와 분지 형태 형성, 그리고 다양한 폐 세포 계보의 형성은 다음과 같은 특정한 상호작용을 필요로 합니다...

본 영상에서는 생쥐 배아 폐의 해부 및 배양 방법이 시연됩니다. 과정은 E 11.5 또는 E 12.5 단계의 배아를 채취하는 것으로 시작됩니다. 그다음, 배아를 절개하여 폐를 추출합니다.그 후 폐를 액체-공기 계면(liquid air interface)에 플레이팅하고 배양 후 인큐베이션합니다. 특정 처리에 반응하여 배아 폐의 중간엽(mesenchyme)과 상피의 성장 및 분지 변화를 실체 현미경을 통해 관찰할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 David War Burton입니다.저는 로스앤젤레스 Ban 연구소 어린이 병원의 발생 생물학 및 재생 의학 프로그램을 총괄하고 있습니다. 그리고 저는 War Burton 박사 연구실의 시니어 박사후 연구원인 Jan Carro입니다. 오늘은 마우스 배아 폐를 분리하여 기관 배양에 배치하는 기술을 보여드리겠습니다.이 기술은 약 20년 전 USC 치과대학의 Tina Jaco Halkin과 Pablo bringus가 처음 기술한 방법에서 발전되었습니다. 저희 실험실에서는 램 분지 형태(lamb branching morphy)를 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.임신 후 11.5일 또는 12.5일에, 이산화탄소로 안락사시킨 적정 시기의 임신 마우스를 층류 후드 내에 등 쪽이 바닥으로 가게 놓습니다. 70% ethanol로 분무합니다. 복부를 절개합니다.그다음 동물의 뒷다리를 잡은 상태에서 피부를 위쪽으로 당겨 제거합니다. 복강을 열고 자궁을 적출합니다. 자궁을 차가운 hanks balanced salt solution 또는 HBSS가 채워진 50 milliliter 원심분리관(conical tube)에 넣고 2분 동안 부드럽게 흔들어 혈액을 씻어냅니다.다음으로, 입체 현미경 하에서 자궁을 페트리 접시로 옮깁니다. 스프링 가위를 사용하여 자궁벽을 절개하여 배아를 방출시킵니다. 그런 다음 타공 스푼을 사용하여 배아를 수확하고 HBSS가 담긴 페트리 접시에 넣은 후 얼음 위에 둡니다.실체 현미경 하에서 작업을 계속하며 배아 폐의 해부를 시작합니다. 우선 배아를 왼쪽으로 눕힙니다. 왼손에 핀셋을 잡고 오른쪽 앞다리를 제거합니다.사지 개구부부터 배아를 절개하고 피부를 제거합니다. 이 단계를 통해 내부 장기를 확인하고 다음 단계를 위해 심장과 폐의 위치를 파악할 수 있습니다. 심장을 제거합니다.배아 폐는 심장의 후방과 척추의 전방에 위치합니다. 다음으로, 배아에서 손상되지 않은 폐를 분리합니다. 그런 다음 불필요한 조직과 식도를 제거합니다.폐를 적출한 후, 멸균 전송 피펫을 사용하여 얼음 위에 놓인 차가운 HBSS가 담긴 페트리 접시로 옮깁니다. non-clone delta polystyrene 접시의 각 웰에 50 units/mL의 penicillin streptomycin이 첨가된 D-M-E-M-F 12를 0.5에서 1 mL까지 넣습니다. 그다음, 배지 위에 nucleo polycarbonate track etch membrane의 매끄러운 면이 아래로, 거친 면이 위로 향하게 하여 올립니다.멸균 전송 피펫을 사용하여 적출한 배아 폐를 핵공 폴리카보네이트 트랙 식각 막(nucleo polycarbonate track etch membrane) 위에 놓습니다. 실체 현미경을 사용하여 배아 폐의 위치를 조정합니다. 배아 폐는 여기 보이는 것처럼 기관이 손상되지 않은 상태로 일직선으로 놓여 있어야 합니다.모든 폐가 동일한 내부 압력을 갖도록 한 후, 디쉬를 세포 배양기에 옮겨 원하는 시간 동안 배양합니다. 여기서는 E 12.5 폐를 FGF9 존재 여부에 따라 배양하였습니다. FGF9은 섬유아세포 성장 인자 가족의 일원으로, in vitro에서 48시간 동안 배양된 폐의 간질 확장과 상피 확장을 유도합니다.FGF nine가 없을 때 가지치기가 증가하는 것이 관찰됩니다. 이 이미지들은 실체 현미경으로 촬영한 배아 폐의 사진입니다. 이와 대조적으로, FGF nine가 있는 상태에서 48시간 동안 성장한 폐는 상피가 확장되고 그물 모양을 띱니다.24시간 배양 후의 모습입니다. 48시간이 지나면 상피세포에 미치는 영향이 더욱 뚜렷하게 나타납니다. 지금까지 생쥐 배아 폐의 기관 배양 준비 방법을 살펴보았습니다.이 절차를 수행할 때 조직의 퇴행을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 배아에서 폐를 제거하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 시청해 주셔서 감사합니다. 이 기술이 유용하게 활용되기를 바랍니다.실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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