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암 연구
0 조회수 • 6:00 분 • April 30th, 2023
- HCR-FISH 또는 hybridization chain reaction-fluorescence in situ hybridization은 바이러스에 감염된 세포의 게놈 내에서 바이러스 핵산 염기서열을 검출합니다. 먼저 바이러스에 감염된 세포의 부착 배양을 수정하고 세포막을 투과화합니다. 혼성화 버퍼로 세포를 배양하여 백그라운드 신호를 줄입니다. HCR 개시 서열과 바이러스 DNA를 표적으로 하는 상보적 염기서열을 운반하는 개시 프로브로 세포를 처리합니다. 샘플을 가열하여 숙주 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 변성시킵니다. 프로브가 무료 표적 바이러스 DNA 염기서열에 결합할 수 있도록 샘플을 배양합니다.
다음으로, 두 세트의 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 헤어핀 프로브인 H1 및 H2를 포함하는 증폭 버퍼로 처리합니다. 교잡 연쇄 반응을 촉진하기 위해 배양합니다. 짝을 이루지 않은 이니시에이터 서열은 상보적인 H1 꼬리에 결합하여 헤어핀 구조를 선형화합니다. 노출된 H1 서열은 유사하게 상보적인 H2 꼬리에 결합합니다. 후행 H2는 H1 꼬리에 계속 결합합니다. 이러한 방식으로 형광 태그가 지정된 프로브는 대상 부위 주위에서 증폭되어 강력한 신호를 방출합니다. 샘플을 DAPI로 처리하여 세포핵을 염색합니다.
형광 현미경을 사용하여 감염된 세포의 핵 내 복제 초점에서 밝은 형광을 검출합니다. 다음 프로토콜에서는 감염된 1차 인간 피부 세포에서 Merkel Cell Polyomavirus 게놈을 검출하기 위한 in situ HCR-DNA FISH를 보여줍니다.
- 먼저 PBS에서 4% PFA로 10분 동안 커버 슬립에 셀을 고정합니다. 그런 다음 커버 슬립을 PBS로 두 번 세척하고 하룻밤 동안 섭씨 70도에서 4% 에탄올로 처리하여 세포를 투과시킵니다. 다음 날, 에탄올을 프로브 수화 완충액으로 교체하고 실온에서 60분 동안 배양하여 샘플을 사전 하이브리드화합니다. 사전 혼성화 배양이 끝나기 30분 전에 프로브 혼성화 용액에 프로브를 1:500 희석으로 희석하고 섭씨 45도에서 배양합니다.
배양이 완료되면 약 10마이크로리터의 희석된 프로브 혼합물을 각 커버 슬립에 대한 현미경 슬라이드에 피펫팅합니다. 각 커버 슬립을 셀 면이 아래로 향하게 하여 혼성화 혼합물의 해당 방울에 놓습니다. 충분한 양의 고무 시멘트를 사용하여 각 덮개 슬립의 가장자리와 뒷면을 슬라이드에 밀봉합니다. 히트 블록의 평평한 면에 슬라이드를 놓고 94분 동안 섭씨 3도까지 가열합니다. 그런 다음 슬라이드를 가습실로 옮기고 밤새 섭씨 45도에서 배양합니다.
다음날 집게를 사용하여 고무 시멘트를 조심스럽게 떼어냅니다. 커버 슬립을 셀 면이 위로 향하게 하여 24웰 플레이트의 웰에 넣고 실온에서 프로브 세척 버퍼로 세 번 세척합니다. 커버 슬립이 포함된 각 웰에 200마이크로리터의 증폭 완충액을 추가하고 실온에서 30-60분 동안 배양합니다. 한편, 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 헤어핀을 각각 어닐링하여 별도의 PCR 튜브에 있는 프로브를 90초 동안 섭씨 95도로 가열한 다음 30분 동안 실온으로 냉각시켜 프로브를 인식합니다. 1:50의 희석액으로 증폭 버퍼에 헤어핀을 함께 혼합합니다.
다음으로, 12웰 플레이트 뚜껑의 열린 면 위로 파라핀 필름을 늘려 증폭 반응을 위한 표면을 만듭니다. 피펫: 50-100마이크로리터의 헤어핀 혼합물 방울을 각 커버 슬립에 대한 파라핀 필름에 떨어뜨립니다. 집게를 사용하여 사전 증폭 용액에서 각 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 가장자리를 다공성 일회용 물티슈에 대고 건조시킵니다. 건조된 각 커버 슬립을 셀 면이 아래로 향하게 하여 증폭 액적에 놓습니다. 플레이트 뚜껑을 가습 챔버로 옮기고 실온과 어두운 곳에서 밤새 배양합니다.
다음 날, 커버 슬립을 24웰 플레이트의 웰로 되돌립니다. 밀리리터당 0.5마이크로그램의 농도로 SSCT 함유 DAPI 5개를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 실온에서 5x SSCT로 샘플을 두 번 세척합니다. 세척된 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 장착하고 도립 형광 현미경을 사용하여 세포를 분석하고 샘플을 이미지화합니다.