1차 쥐 멜라닌 세포 및 섬유아세포의 빠른 배양: 전체 쥐 피부 샘플에서 멜라닌 세포 및 섬유아세포 분리

- 피부는 서로 다른 층을 채우는 다양한 세포로 구성되어 있습니다. 멜라닌을 생산하는 세포인 멜라닌 세포는 표피-진피 접합부에 국한되어 있는 반면, 결합 조직 생성 세포인 섬유아세포는 진피에 있습니다.

멜라닌 세포와 섬유아세포를 빠르게 분리하려면 먼저 안락사된 새끼 쥐의 몸통을 채취합니다. 몸통의 길이를 통해 피부를 배쪽으로 자릅니다. 표피층과 진피층을 포함하는 피부를 벗겨내고 조직을 작은 조각으로 다집니다.

이제 세포외 기질을 분해하는 트립신(trypsin)과 콜라겐분해효소(collagenase) 효소가 함유된 소화 완충액으로 치료하여 세포를 현탁액으로 방출합니다. 세포를 펠릿화하고 상층액을 버리는 원심분리기. 멜라닌 세포 배지에 세포를 재현탁시키고 현탁액을 멀티웰 플레이트로 전달합니다.

배양 중에 대부분의 섬유아세포는 웰 바닥에 부착되는 반면 멜라닌 세포 및 기타 표피 세포는 현탁 상태로 남아 있습니다. 부유 세포를 흡인하고 섬유아세포 배양액에 섬유아세포 특이적 배지를 추가하여 성장을 촉진합니다. 흡인된 현탁액을 콜라겐이 코팅된 새로운 웰로 옮겨 부착 배양 형성을 돕습니다.

항생제인 제네티신을 보충하고 새로운 멜라닌 세포 성장 배지를 추가합니다. Geneticin은 남아 있는 섬유아세포를 선택적으로 제거하는 반면, 배지는 다른 표피 세포 유형보다 멜라닌 세포의 성장을 촉진합니다. 다음 프로토콜에서는 쥐 새끼 피부에서 멜라닌 세포와 섬유아세포를 분리합니다.

- 층류 캐비닛에서 안락사된 각 쥐의 몸통을 70% 에탄올이 함유된 멸균 페트리 접시에 간단히 굴립니다. 에탄올에서 마우스를 꺼내 빈 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, 수술용 가위를 70% 에탄올로 살균합니다. 이 가위를 사용하여 몸통의 복부 쪽 피부를 목에서 시작하여 꼬리까지 절개합니다. 멸균 집게를 사용하여 마우스의 몸통에서 피부를 벗겨내고 피부의 진피 쪽에서 과도한 지방 조직을 제거합니다.

진피 면이 아래를 향하게 하여 3ml의 1x 항생제/항진균 용액이 들어 있는 6웰 접시에 피부를 놓습니다. 실온에서 2-3분 동안 배양합니다. 그런 다음 조직 다지기를 켜고 여기에 표시된 설정으로 설정을 조정합니다.

- 티슈 다지기 날을 설치할 때와 기계를 작동할 때 반드시 주의하십시오.

- 진피 쪽이 아래로 향하게 하여 피부를 멸균 조직 다지기 접시에 옮기고 조직 다지기 접시에 피부를 완전히 3회 통과시킵니다. 그 후, 균질화된 피부를 3ml의 피부 소화 완충액이 들어 있는 멸균 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

P1000 마이크로피펫을 사용하여 10-15회 격렬하게 위아래로 피펫팅하여 생성된 현탁액을 혼합합니다. 원뿔형 튜브에 뚜껑을 씌우고 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 샘플을 배양하고 3-5분마다 튜브를 뒤집습니다.

다음으로, 실온에서 750 x g의 스윙 버킷 로터에서 튜브를 5분 동안 원심분리하여 피부 내 세포를 펠릿화합니다. P1000 마이크로피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 피부 소화 완충액을 천천히 완전히 제거합니다.

- 모든 피부 소화 완충액을 흡인해야 합니다. 문제가 있는 경우 2-3ml의 멜라닌 세포 배지로 세포 펠릿을 세척하고 원심분리를 반복하여 과도한 피부 소화 완충액을 제거하십시오.

- 그런 다음 P1000 피펫으로 15-20회 위아래로 피펫팅하여 1ml의 멜라닌 세포 배지에 세포 펠릿을 철저히 재현탁합니다. 생성된 세포 용액을 1ml의 멜라닌 세포 배지가 포함된 6웰 접시에 있는 코팅되지 않은 웰로 적하 방향으로 옮깁니다. 도금된 피부 균질액을 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 5% 이산화탄소와 함께 40분 동안 배양합니다.

그 후, 코팅되지 않은 접시의 배양 상등액을 미리 세척된 콜라겐이 코팅된 6웰 접시의 한 웰로 옮깁니다. 최종 농도가 밀리리터당 100나노그램이 되도록 매체에 G418을 추가합니다. 코팅되지 않은 접시의 한 웰에 2ml의 섬유아세포 매체를 추가하며, 이제 부착성 섬유아세포가 포함되어 있습니다. 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 두 배양을 하룻밤 동안 배양합니다.

16-24시간의 배양 후 배지와 각 배양의 파편을 별도로 흡인합니다. 각 세척마다 1ml의 PBS를 사용하여 각 접시를 두 번 세척하십시오. 그런 다음 2ml의 신선한 멜라닌 세포 배지를 멜라닌 세포 배양액에 첨가하고 2ml의 신선한 섬유 아세포 배지를 섬유 아세포 배양액에 추가합니다.