재조합 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCPyV) 비리온 제제: 고역가 재조합 MCPyV 비리온을 생산하는 기술

- 메르켈 세포 폴리오마바이러스(MCPyV)는 피부암의 일종인 메르켈 세포 암종을 유발하는 원형 게놈을 가진 이중 가닥 DNA 종양 바이러스입니다. MCPyV virion을 준비하려면 먼저 transfection agent, 바이러스 게놈 및 바이러스 복제를 촉진하는 데 필요한 단백질을 암호화하는 두 개의 발현 플라스미드를 포함하는 칵테일로 포장 세포의 부착 배양을 처리합니다.

배양 중에 transfection 시약은 플라스미드와 함께 lypoplex를 형성하여 포장 세포로의 전달을 용이하게 합니다. 일단 핵 내부로 들어가면 세포 메커니즘은 바이러스 및 플라스미드 게놈의 발현을 허용합니다. 발현 플라스미드는 큰 종양 항원 및 작은 종양 항원 단백질을 암호화합니다. 이 단백질은 핵으로 전위되어 바이러스 DNA 복제를 주도합니다. 그 후, 바이러스 게놈은 구조적 캡시드 단백질을 암호화합니다. 이 단백질은 핵으로 이동하여 재조합 비리온의 조립을 돕습니다.

다음으로 배양된 세포를 수확합니다. 세제와 DNase가 함유된 용액으로 처리하십시오. 세제는 세포를 용해시켜 바이러스를 방출합니다. DNase는 현탁액에서 유리 플라스미드 DNA를 분해합니다. 펠릿의 세포 파편을 분리하기 위한 원심분리기. 바이러스가 포함된 상등액을 적절한 밀도 구배 매체가 있는 튜브에 로드합니다. 그래디언트 매질 내에서 농축된 비리온이 풍부한 분획을 얻기 위한 원심분리기.

다음 프로토콜에서는 293TT 세포를 사용하여 고역가 재조합 MCPyV 비리온을 제조하는 방법을 보여줍니다.

- 늦은 오후 또는 저녁에 600만 개의 293TT-28 세포를 DMEM 배지가 보충된 10cm 접시에 파딩합니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 다음 날 아침에는 세포가 약 50% 정도 밀집되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 66마이크로리터의 트랜스펙션 시약, 12마이크로그램의 재결찰된 MCPyV 분리 R17b DNA, 8.4마이크로그램의 ST 발현 플라스미드 pMtB 및 9.6마이크로그램의 LT 발현 플라스미드 pADL로 세포를 형질주입합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 밤새 세포를 배양합니다.

다음 날, 형질주입된 세포가 거의 합류하면 세포를 트립신화하고 15cm 접시에 옮겨 지속적인 증식을 위해 세포를 이식합니다. 그 접시가 거의 합류하게 되면 세포를 3개의 새로운 15cm 접시로 옮깁니다. 이러한 새로운 접시가 거의 융합되면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 수확합니다. 180 x g의 실온에서 5분간 원심분리기를 사용합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 DPBS-Mg 1 세포 부피를 추가합니다.

25마이크로몰의 황산암모늄을 첨가한 후 0.5% Triton X-100, 0.1% 벤조나제, 0.1%의 ATP 의존성 DNase를 첨가합니다. 잘 섞어 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 얼음에 15분 동안 식힌다. 다음으로 0.17부피의 염화나트륨을 첨가합니다. 섞어서 얼음 위에서 15분 더 배양합니다. 12000 x g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기. 상층액이 투명하지 않으면 튜브를 부드럽게 뒤집고 원심분리를 반복합니다.

그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 0.8 몰의 염화나트륨이 보충된 한 부피의 DBPS에 펠릿을 재현탁시킵니다. 12000 x g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기. 상층액이 투명하지 않으면 튜브를 부드럽게 뒤집고 원심분리를 반복합니다. 두 개의 상층액을 결합하고 12000 x g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 다시 원심분리합니다.

그런 다음 피펫을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 얇은 벽의 5밀리리터 폴리알로머 튜브에 요오딕소날의 구배를 증착합니다. 준비된 요오드딕손 구배(iodixonal gradient) 위에 정화된 바이러스 함유 상등액 3ml를 로드합니다. SW55ti 로터가 있는 원심분리기를 234,000 x g 및 섭씨 16도에서 3.5시간 동안 사용하여 가속 및 감속을 저속으로 설정해야 합니다. 초원심분리가 완료된 후 실리콘화된 튜브에서 12개의 분획을 수집합니다.