1차 인간 각질세포의 유전자 변형: 재조합 레트로바이러스를 이용하여 각질세포를 유전적으로 조작하는 방법

- 각질세포(keratinocyte)는 표피 또는 피부의 가장 바깥층에 존재하는 두드러진 세포 유형입니다. 각질세포를 유전적으로 변형하려면 레트로바이러스 포장 피닉스 세포를 배양하는 것부터 시작하십시오. 그런 다음, 관심 유전자를 운반하는 레트로바이러스 벡터와 transfection 시약을 포함하는 혼합물을 추가합니다. 원하는 시간 동안 플레이트를 배양합니다.

transfection 시약은 바이러스 유전 물질이 포장 세포로 전달되는 것을 용이하게 합니다. 이렇게 특별히 설계된 세포는 레트로바이러스 캡시드 생산에 필요한 단백질을 암호화하고 관심 유전자를 운반하는 레트로바이러스 벡터 RNA의 패키징을 촉진합니다. 포장되면 성숙한 바이러스는 세포를 빠져나와 배지로 들어갑니다. 이제 바이러스에 부유된 배지를 1차 각질세포가 포함된 신선한 배양 접시로 옮깁니다. 원하는 양이온성 폴리머 용액으로 배양액을 증강합니다.

양이온성 폴리머는 바이러스 및 각질세포막의 음전하를 중화하여 세포 표면과의 바이러스 융합 효율성을 높입니다. 융합 시 바이러스는 RNA를 세포 세포질로 방출하고, 세포 세포질은 이중 가닥 DNA로 역전사합니다. 이 바이러스 DNA는 핵으로 들어가 각질세포 게놈과 통합되어 유전적 변형을 일으킵니다. 다음 프로토콜에서는 레트로바이러스 형질주입(retroviral transfection)을 사용한 1차 인간 각질세포의 유전자 변형을 보여줍니다.

- transfection 전날, 완전한 배지의 phoenix 세포를 well당 800,000개 세포의 밀도로 6-well plate에 seed합니다. transfection 당일, transfection할 각 웰에 대해 6μl의 transfection 시약과 100μl의 DMEM을 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. transfection할 각 웰에 대해 3마이크로그램의 레트로바이러스 벡터가 들어 있는 튜브에 혼합물을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이 전체 혼합물을 피닉스 세포의 각 웰에 적방울 방향으로 첨가하고 밤새 세포를 배양합니다.

transfection 다음 날, phoenix 세포에서 배지를 제거하고 2ml의 새로운 완전 배지를 추가합니다. 같은 날, 항생제를 투여한 각질세포 무함유 배지에 1차 인간 각질세포를 재현탁시키고 웰당 75,000개 세포의 밀도로 6웰 플레이트에 시드를 주입합니다.

다음 날, 형질주입된 피닉스 세포의 바이러스 입자가 포