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- 군집 형성 분석은 개별 세포가 증식하고 군체를 형성하는 능력을 측정합니다. 배양 플레이트에서 절제된 쥐-등쪽 피부로 시작합니다. 피부의 복부 쪽에서 피하 조직과 지방을 긁어냅니다. 소화액으로 조직을 처리하십시오. 용액의 단백질 분해 효소는 세포외 기질을 분해하여 표피 세포 해리를 유도합니다.
표피층을 부드럽게 긁어내어 해리 세포와 털을 수확 배지로 방출합니다. 적절한 스트레이너를 통해 현탁액을 여과하여 머리카락이나 파편을 걸러내고 표피 세포의 단세포 현탁액을 얻습니다. 이 세포 현탁액의 원하는 부피를 성장이 저지된 영양 세포의 부착층을 포함하는 콜라겐 코팅된 플레이트로 전달합니다. 각질세포 생존에 유리한 적절한 배지를 보충하십시오.
배양 중에 각질 세포는 피더 층에 부착됩니다. 또한 이러한 영양 세포는 성장 인자를 분비하고 각질 세포의 성장을 지원하는 세포 외 기질 단백질을 합성합니다. 개별 각질세포의 증식 능력에 따라 군체를 형성하기 시작합니다. 미디어를 제거하고 식민지를 수정하십시오. 계수를 위해 군체를 검출하기 위해 적절한 염료로 세포를 염색합니다. 다음 프로토콜에서는 테스트 화합물로 처리한 후 성체 마우스에서 수확한 1차 각질세포의 클론 생성 분석을 수행합니다.
- 안락사된 성체 쥐에서 등쪽 피부 샘플을 채취한 후 고압멸균 집게와 메스를 사용하여 털이 있는 쪽이 아래로 향하게 한 번에 하나의 등쪽 피부를 얇은 페트리 접시에 넣고 조직이 반투명해질 때까지 피부 조직의 복부 쪽에서 지방을 포함한 피하 조직을 긁어냅니다.
긁어낸 이 스킨을 다른 모든 스킨이 처리될 때까지 PBS에 놓습니다. 그런 다음 메스를 사용하여 피부 샘플을 0.5 x 1에서 1.5cm 스트립으로 자릅니다. 스프레이 면이 위로 향하게 하여 샘플을 20ml PBS와 0.25% 트립신이 보충된 100 x 20mm 페트리 접시의 표면에 털이 많은 면이 위로 향하게 뜨게 한 후 섭씨 32도에서 2시간 동안 샘플을 뜨게 합니다.
배양이 끝나면 15ml의 수확 배지가 들어 있는 멸균 플라스틱 사각형 페트리 접시를 30도 경사로 놓고 구부러진 집게를 사용하여 떠 있는 피부 스트립을 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 새 메스 날을 피부에 수직으로 잡고 충분하지만 과하지 않은 힘을 사용하여 샘플의 표피와 털을 배지로 긁어냅니다.
모든 스트립을 긁어낸 후 표피 세포 함유 상층액을 1.5인치 마그네틱 교반 막대가 들어 있는 멸균 60ml 병에 조심스럽게 디캔팅하고 추가 수확 배지로 페트리 접시를 헹구어 남아 있는 표피 세포를 수집합니다.
새로운 배지로 병의 최종 부피를 30ml로 가져오고 표피 세포 용액을 실온에서 20분 동안 분당 100회 회전으로 저어줍니다. 교반 배양이 끝나면 생물 안전 캐비닛에서 교반 막대를 제거하고 70 마이크로 미터 여과기를 통해 세포 용액을 50 밀리리터 원추형 튜브로 여과합니다.
겸자를 사용한 다음 피펫을 사용하여 스트레이너를 통해 모발과 각질층 물질을 눌러 조직을 조작하여 갇힌 유모 세포를 해제하고 추가로 5ml의 수확 배지를 사용하여 갇힌 나머지 유모 세포를 튜브로 방출합니다.
- 표피 세포와 털을 조작하여 모낭에서 세포를 분리하는 것이 중요합니다.
- 새 배지로 튜브의 총 부피를 최대 50ml까지 가져오고 원심분리로 세포 여과액을 수집합니다. 펠릿을 5ml의 신선한 수확 배지에 재현탁시키고 5ml 피펫으로 약 20회 분쇄합니다. 0.5:1 희석액 20ml를 2ml 마이크로퓨지 튜브에 옮깁니다.
샘플을 조심스럽게 혼합한 후 마이크로분리 튜브에서 200마이크로리터를 꺼내 동일한 부피의 0.4% Trypan Blue 용액과 부드럽게 혼합합니다. 이 용액을 세 번 부드럽게 혼합하고 세포를 혈구계로 옮겨 유핵이 있는 각질세포를 계수합니다.
모든 짙은 파란색 세포를 생존 불가능한 세포로 점수를 매기고 작은 황금빛 분홍빛을 띤 세포를 생존 세포로 점수를 매깁니다. 생존율은 평균 약 80%이며, 생쥐 한 마리당 최종 각질 세포 수율은 약 3,000만 개의 생존 가능한 세포가 되어야 합니다. 카운팅 후 다른 원심분리로 세포를 수집하고 대량 배양을 위해 2 밀리리터의 세포 배양 배지에서 35mm 페트리 접시 당 2-4 배 10-6 번째 생존 가능한 각질 세포를 재현탁합니다.
클론 생성 콜로니 형성 분석을 위해, X선이 조사된 스위스 마우스 3T3 피더층에서 콜라겐으로 코팅된 60mm 페트리 접시당 보충제 및 혈청 농도를 함유한 변형된 William's E 배지 4ml당 1배에서 3번째 각질세포에 1배로 세포를 재현탁합니다.
대량 배양의 경우 적절한 세포 배양 기간 동안 5% 이산화탄소에서 섭씨 32도에서 배양액을 성장시키고, 대량 배양을 위해 초기 파종 후 24시간 후와 그 후 일주일에 3회 배지를 변경합니다.
클론 배양이 끝나면 배지를 흡인하고 실온에서 밤새 10% 완충 포르말린으로 콜로니를 고정합니다. 다음날 아침, 0.5% 로다민 B로 콜로니를 오토클레이브 물에 1시간 동안 염색한 후 물이 맑아질 때까지 차가운 오토클레이브 물로 접시를 헹굽니다. 그런 다음 식민지를 세기 전에 뚜껑에 있는 접시를 기울여 말리십시오.
