miniCoopR 벡터 기반 형질전환: 제브라피시 종양 모델에서 흑색종 유발 유전자를 스크리닝하는 기술

- 제브라피시에서 흑색종은 멜라닌 생성 세포인 멜라닌 세포의 악성 변형으로 인해 발생합니다. 흑색종 발병을 연구하려면 흑색종이 발생하기 쉬운 멜라닌 세포가 결핍된 형질전환 제브라피시 모델을 사용합니다. 이 모델은 멜라닌 세포 특이적 미트파 프로모터의 기능 상실 돌연변이로 인해 멜라닌 세포가 부족합니다.

이 형질전환 모델의 단세포 배아를 한천 플레이트에서 채취하는 것으로 시작합니다. 트랜스포손 기반 miniCoopR 벡터와 트랜스포사제 효소 mRNA를 포함하는 혼합물을 배아에 동시 주입합니다. 벡터는 두 개의 transposon elements 사이에 끼워진 후보 유전자에 결합된 promoter-carry mitfa minigene을 포함하는 유전자 카세트를 포함합니다.

동시 주입된 mRNA는 트랜스포사제 단백질을 인코딩합니다. 이 단백질은 트랜스포존 요소에 작용하여 miniCoopR 벡터에서 카세트 절제를 촉매한 다음 배아의 게놈 DNA로 통합합니다. 그 후, cassette promoter는 mitfa 유전자와 관심 후보 유전자 모두의 발현을 유도합니다.

mitfa 유전자는 멜라닌 세포 구제 및 발달을 지원하는 반면, 후보 유전자는 발암성 인 경우 흑색종 발병을 유도합니다. 개발된 제브라피시를 선별합니다. 구조된 멜라닌 세포를 가진 형질전환 물고기는 멜라닌 색소 침착을 일으키고, 흑색종을 가진 물고기는 색소 병변이 융기

다음 프로토콜에서는 형질전환 제브라피시 종양 모델에서 miniCoopR 벡터를 사용하여 흑색종 발병 변형제의 스크리닝을 보여줍니다.

- 주입을 위한 구조체를 생성하려면 PCR을 통해 관심 유전자의 full-length open reading frame을 증폭하고 pDONR221로 재조합하여 Gateway middle entry clone을 생성하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 Multisite Gateway 기술을 사용하여 멜라닌 세포 특이적 mitfa promoter, 관심 유전자 및 polyadenylation 신호를 miniCoopR 벡터에 재조합하여 관심 유전자를 mitfa promoter의 제어 하에 둡니다.

Tol2 transposase mRNA 25피코그램과 함께 각 클론 25피코그램을 단세포, 형질전환, 삼중 동형접합 제브라피시 배아에 주입합니다. mitfa-BRAF-p53 돌연변이 동물은 멜라닌 세포가 결핍되어 변형 및 흑색종 형성이 용이합니다. 관심 유전자와 함께 miniCoopR 벡터에는 구출 mitfa minigene이 포함되어 있습니다. 따라서 성공적으로 주입된 동물은 관심 유전자를 발현하는 구조된 멜라닌 세포를 발달시킵니다.

주입된 배아를 섭씨 28.5도에서 배양합니다. 수정 후 24시간(hpf)에 죽은 배아를 제거합니다. 수정 후 72시간이 지나면 흰색 배경의 입사광 아래에서 해부 현미경을 사용하여 구조된 멜라닌 세포가 있는 형질전환 동물을 선택합니다.

동물이 수정 후 4일이 되면 제브라피시 시설의 보육원에 있는 3리터 탱크로 옮깁니다. 생후 2개월이 되면 멜라닌 세포 구조 영역이 4mm 제곱미터 이상인 동물을 선택합니다. 매주 선택한 동물을 검사하여 종양의 존재 여부를 확인합니다. 연구를 위해 종양이 있는 동물을 격리합니다.

가로 좌표에 연령 및 주수에 따른 흑색종이 없는 생존 곡선을 그리고 세로좌표에 흑색종이 없는 생존율을 그립니다. 멜라닌 세포에서 EGFP를 발현하는 동물을 대조하기 위해 관심 유전자를 발현하는 멜라닌 세포와 비교합니다. 로그 순위 검정을 사용하여 두 곡선이 통계적으로 다른지 여부를 확인합니다.