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암 연구
0 조회수 • 4:07 분 • April 30th, 2023
- 제브라피시에서 흑색종은 멜라닌 생성 세포인 멜라닌 세포의 악성 변형으로 인해 발생합니다. 흑색종 발병을 연구하려면 흑색종이 발생하기 쉬운 멜라닌 세포가 결핍된 형질전환 제브라피시 모델을 사용합니다. 이 모델은 멜라닌 세포 특이적 미트파 프로모터의 기능 상실 돌연변이로 인해 멜라닌 세포가 부족합니다.
이 형질전환 모델의 단세포 배아를 한천 플레이트에서 채취하는 것으로 시작합니다. 트랜스포손 기반 miniCoopR 벡터와 트랜스포사제 효소 mRNA를 포함하는 혼합물을 배아에 동시 주입합니다. 벡터는 두 개의 transposon elements 사이에 끼워진 후보 유전자에 결합된 promoter-carry mitfa minigene을 포함하는 유전자 카세트를 포함합니다.
동시 주입된 mRNA는 트랜스포사제 단백질을 인코딩합니다. 이 단백질은 트랜스포존 요소에 작용하여 miniCoopR 벡터에서 카세트 절제를 촉매한 다음 배아의 게놈 DNA로 통합합니다. 그 후, cassette promoter는 mitfa 유전자와 관심 후보 유전자 모두의 발현을 유도합니다.
mitfa 유전자는 멜라닌 세포 구제 및 발달을 지원하는 반면, 후보 유전자는 발암성 인 경우 흑색종 발병을 유도합니다. 개발된 제브라피시를 선별합니다. 구조된 멜라닌 세포를 가진 형질전환 물고기는 멜라닌 색소 침착을 일으키고, 흑색종을 가진 물고기는 색소 병변이 융기
된 것을 가지고 있습니다.다음 프로토콜에서는 형질전환 제브라피시 종양 모델에서 miniCoopR 벡터를 사용하여 흑색종 발병 변형제의 스크리닝을 보여줍니다.
- 주입을 위한 구조체를 생성하려면 PCR을 통해 관심 유전자의 full-length open reading frame을 증폭하고 pDONR221로 재조합하여 Gateway middle entry clone을 생성하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 Multisite Gateway 기술을 사용하여 멜라닌 세포 특이적 mitfa promoter, 관심 유전자 및 polyadenylation 신호를 miniCoopR 벡터에 재조합하여 관심 유전자를 mitfa promoter의 제어 하에 둡니다.
Tol2 transposase mRNA 25피코그램과 함께 각 클론 25피코그램을 단세포, 형질전환, 삼중 동형접합 제브라피시 배아에 주입합니다. mitfa-BRAF-p53 돌연변이 동물은 멜라닌 세포가 결핍되어 변형 및 흑색종 형성이 용이합니다. 관심
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