0 조회수 • 3:45 분 • April 30th, 2023
- 전사 인자(transcription factor)는 DNA 결합 도메인을 포함하는 단백질입니다. 이들은 특정 DNA 염기서열에 결합하고 세포의 유전자 발현을 조절하는 데 도움을 줍니다. 비늘 관련 멜라닌 세포에서 전사 인자 발현을 검출하려면 먼저 마취된 제브라피시에서 어두운 색소의 등쪽 비늘을 수확합니다. 비늘을 고정하고 투과화 용액으로 처리하여 개별 멜라닌 세포를 투과할 수 있도록 합니다.
표백제 용액으로 처리하여 세포에서 어두운 멜라닌 색소 과립을 제거합니다. 이 표백 과정은 후속 염색 단계에서 색소 관련 배경 신호의 가능성을 제거합니다. 세포 표면의 비특이적 단백질 결합 부위를 차단하기 위해 단백질이 포함된 차단 용액으로 배양합니다.
이제 원하는 1차 항체로 샘플을 처리합니다. 이러한 항체는 세포 내의 표적 전사 인자에 결합합니다. 다음으로, 1차 항체에 특이적인 형광 표지된 2차 항체로 샘플을 라벨링합니다. 또한 적절한 형광 DNA 결합 염료로 샘플을 처리하여 세포핵을 염색합니다. 형광 현미경을 사용하여 전사 인자-항체 복합체 및 세포핵에서 밝은 형광 방출을 감지합니다.
다음 프로토콜에서는 형질전환 제브라피시에서 멜라닌세포 유도 전사 인자-A 또는 mitfa를 발현하는 배쪽 비늘 관련 멜라닌 세포의 면역 염색을 보여줍니다.
- 면역 염색을 수행하려면 트리카인 밀리리터당 0.17mg으로 물고기를 마취합니다. 해부 현미경으로 입사광을 사용하여 날카롭고 끝이 가는 집게를 사용하여 등쪽 비늘을 뽑아내고 멜라닌 세포를 포함하는 비늘의 절반이 손상되지 않도록 주의합니다. 집게에서 직접 저울을 1ml의 정착액에 넣고 뒤집는 동안 실온에서 2시간 이상 배양합니다. 물고기를 물고기 물에 옮기고 물고기를 모니터링하여 성공적인 회복을 확인하십시오.
색소가 함유된 멜라닌 세포를 표백하려면 먼저 PBST의 고정 스케일을 실온에서 5분 동안 2회 세척합니다. 다음으로, 갓 만든 표백제 용액 1ml를 넣고 파라 필름 또는 캡 잠금 장치로 덮어 가스가 튜브가 터지는 것을 방지합니다. 색소가 사라질 때까지 표백을 계속하십시오. 그런 다음 PBST로 실온에서 5분 동안 4회 세척합니다.
블록 용액에서 최소 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 약 400마이크로리터의 1차 항체를 블록 용액에 넣어 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 실온의 PBST에서 30분 동안 저울을 세 번 세척합니다. 2차 항체로 실온에서 2시간에서 하룻밤 동안 배양합니다.
DAPI로 염색한 후 유리 슬라이드에 vectashield 한 방울을 바르고 저울의 오목한 면이 슬라이드에 대해 아래를 향하도록 저울을 장착합니다. 샘플 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다. 투명 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰합니다.