JoVE 실험 백과사전
암 연구
0 조회수 • 4:05 분 • April 30th, 2023
- 흑색종 이식 분석 중에 종양 보유 제브라피쉬의 암세포를 면역 저하 수용자 모델에 이식하여 종양 발생을 연구합니다. 먼저 안락사된 종양 보유 기증자인 제브라피시를 채취하여 몸에서 종양을 외과적으로 절제합니다. 종양을 적절한 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 옮기고 작은 조각으로 다집니다.
다음으로, 피펫을 사용하여 종양 조각을 분쇄합니다. 이것은 종양 조각을 개별 세포로 해리합니다. 이제 종양 세포 현탁액을 주사기에 로드합니다. 그런 다음 면역이 저하된 수용자 캐스퍼 제브라피시를 여과지에 준비합니다. 이 색소 결핍 제브라피시의 돌연변이 변종은 멜라닌 세포와 홍채 세포가 없어 투명하고 이미징 및 이식 실험에 다재다능합니다.
다음으로, 캐스퍼 제브라피쉬의 뒷뇌와 등지느러미 사이의 중간에 있는 복막강 위 영역에 사전 로드된 흑색종 세포 현탁액을 피하로 주입합니다. 이제 수혜 물고기를 물 속으로 옮기고 모니터링하여 종양 발달을 관찰합니다. 제브라피쉬의 투명한 몸체는 발달된 종양을 쉽게 시각화하는 데 도움이 됩니다.
다음 프로토콜에서는 형질전환 종양 보유 제브라피시 기증자에서 면역 저하 수혜자 캐스퍼 피쉬 모델로의 흑색종 세포 이식을 보여줍니다.
- 이식 하루 전에 수혜자 2-3개월 된 캐스퍼 피쉬에게 25Gy의 감마선을 조사한 후 물고기가 물고기 물에서 회복할 수 있도록 합니다. 트리카인을 사용하여 종양이 있는 물고기를 안락사시킵니다. 종양을 잘라내고 약 5ml의 필터가 있는 페트리 접시에 넣고 5% FPS로 0.9x PBS를 멸균합니다. 면도기로 용액에 있는 동안 종양을 깍둑썰기합니다.
실온에서 P1000 피펫으로 작업하여 단일 세포를 생산합니다. 볼륨을 25밀리리터로 올립니다. 40마이크로미터 메쉬 필터를 통해 용액을 여과하고 453rcf의 탁상용 원심분리기에서 10분 동안 회전합니다. 펠릿을 0.9% PBS, 5% FBS에서 원하는 농도로 재현탁합니다.
혈구계를 사용하여 정확한 세포 수를 계산하고 최종 주입량이 약 5마이크로리터가 되도록 세포 현탁액을 희석합니다. 예를 들어, 50,000개의 세포를 주입해야 하는 경우 세포 현탁액을 마이크로리터당 10,000개의 최종 농도로 희석해야 합니다. 세포 현탁액이 들어 있는 튜브를 몇 분마다 튕겨 세포가 뭉치는 것을 방지합니다.
100% 에탄올과 0.9x PBS를 사용하여 26s 게이지(베벨 팁) 701 N 10 마이크로리터 해밀턴 주사기를 2-3회 세척한 후 주사기에 5 마이크로리터의 세포 현탁액을 로드합니다. 방사선 조사된 수혈 피쉬를 트리카인으로 마취한 후 젖은 Kimwipe에 옆으로 눕힙니다.
한 손으로 물고기를 안정시키고 경사가 45도 각도를 향하도록 바늘을 뒷뇌의 후방 경계와 등지느러미의 내부 경계 사이의 약 중간 지점인 복막강 위의 물고기 측면에 삽입합니다.플런저를 부드럽게 누릅니다. 물고기가 민물고기 물에서 회복되도록 하고 종양 생착을 위해 매일 물고기를 관찰하십시오. 생착이 발생한 경우 지속적인 성장과 질병 발생도 관찰할 수 있습니다.