에서 다세포 행동을 기록 Myxococcus 산투스 Biofilms

다음 실험의 전반적인 목표는 재현 가능하고 정량화 가능한 결과를 생성할 수 있을 만큼 충분히 엄격한 저렴한 타임랩스 마이크로 촬영 기법 분석을 개발하는 것입니다. 이는 저렴하고 재사용 가능한 실리콘 개스킷을 사용하여 아그로스 미디어 플레이트 또는 현미경 슬라이드를 구성함으로써 달성됩니다. 이러한 플레이트 복합체가 다양한 매체 유형과 한천 농도에 걸쳐 일주일 이상 수화되고 충분히 산소가 공급된 상태를 유지한다는 것을 보여주는 결과가 얻어졌습니다.

또한 타임랩스 마이크로 시네마토그래피는 느린 프로세스이기 때문에 8개의 저렴한 현미경을 사용하면 데이터 수집을 가속화하는 데 도움이 됩니다. 안녕하세요, 저는 시라큐스 대학교 생물학과의 로이 웰치 박사 연구실의 라이언 테일러입니다. 오늘 우리는 실험실에서 박테리아 생물막의 타임 랩스 영화를 만드는 절차를 보여 드릴 것이며, 이 절차를 사용하여 MTI 생물막의 다세포 거동을 연구할 것입니다.

시작하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 하룻밤 동안 Occus sanus 배양액의 세포 밀도를 측정하고, 클럿 미터로 배양액 1ml를 2.5ml 원심분리기 튜브 펠릿 세척으로 옮기고, 함께 제공된 서면 프로토콜, 피펫 및 와류에 설명된 대로 TPM 배지에 박테리아를 재현탁시켜 펠릿을 완전히 재현탁시키며, 이는 시간이 걸릴 수 있습니다. 다음으로, 분석 매체인 TPM 50ml에 0.5g의 aros를 추가합니다.

또한 살균을 위한 영양 디스크 매체 오토클레이브인 C-T-T-Y-E 50밀리리터에 0.5g의 아로스를 첨가합니다. 그런 다음 인큐베이터 또는 수조에서 미디어를 섭씨 55도로 유지하십시오. 추적 분석을 구성하는 동안.

플레이트 복합체는 영양 디스크 최초의 화염 살균기 유리 현미경을 구성하기 위해 진행됩니다. 0.5mm 두께의 멸균 실리콘 고무 개스킷을 슬라이드 위에 밀어 놓습니다. 약 300마이크로리터의 C TT YE 매체를 피펫으로 주입하면 슬라이드의 개스킷에 의해 생성된 우물 안으로 유입됩니다.

C-T-T-Y-E 미디어 농업은 화염을 쌓아 올리고 다른 슬라이드를 살균한 다음 C-T-T-Y-E 미디어 어로 위에 비스듬히 내려놓아야 합니다. 슬라이드를 비스듬히 내려 놓으면 기포 형성을 방지할 수 있습니다. 슬라이드가 제자리에 놓이면 양쪽에 하나씩 미니 바인더 클립으로 단지를 통통하게 만듭니다.

클리핑된 복합체를 섭씨 4도에 놓고 C-T-T-Y-E 미디어 어그로가 설정되도록 합니다. 이 작업은 일반적으로 약 5분 정도 걸립니다. 농업이 설정되면 추적 분석에 사용되는 플레이트 복합체를 준비할 수 있습니다.

분석 복합체를 구성하기 위한 슬라이드를 준비하는 것으로 시작합니다. 각 복잡한 화염에 대해 두 개의 유리 현미경 슬라이드를 살균했습니다. 슬라이드 중 하나의 위에 오토클레이브 개스킷을 배치하여 분석의 바닥을 형성합니다.

다른 슬라이드는 아그로스를 평평하게 만들고 지지 슬라이드로 사용됩니다. 분석의 상단은 커버 슬립입니다. 먼저 현미경 슬라이드를 라벨링 테이프로 감싼 다음 화염 살균기 유리 커버 슬립을 소독하여 소독된 포장된 슬라이드 위에 놓습니다.

감긴 슬라이드를 위로 밀어 올리면 커버 슬립이 깨지지 않도록 합니다. 화염 살균 덮개 위에 오토클레이브 개스킷을 놓고 집게로 밀어 넣습니다. 하단 슬라이드의 개스킷과 커버 슬립을 아래로 눌러 유리와 밀봉을 형성하는지 확인합니다.

그렇지 않으면 어레이의 미디어가 건조될 수 있습니다. 슬라이드 개스킷과 커버 슬립 개스킷 어셈블리를 멸균된 면이 위로 향하게 하여 여기서부터 한 번에 하나의 복합체에서만 작업하여 미디어 아그로스가 응고되어 영화 품질이 저하되는 것을 방지하십시오. 영양 디스크를 넣는 것으로 시작합니다.

섭씨 4도에서 영양 디스크 복합체를 제거합니다. 바인드 이클립스와 이전 부분을 제거하여 100 마이크로 리터 유리 일회용 팁이있는 마이크로 샘플링 피펫을 사용하여 현재 응고된 C-T-T-Y-E aros를 노출시키는 슬라이드를 제거합니다. C-T-T-Y-E 매체 농업에서도 1mm 직경의 영양 디스크를 제거하고 커버 슬립의 개스킷에 의해 생성된 웰에 넣습니다.

그런 다음 인큐베이터와 피펫 300마이크로리터에서 TPM 배지를 커버 슬립의 개스킷에 의해 생성되고 영양 디스크가 들어 있는 웰로 회수합니다. TPM 미디어 Agros는 T-P-M-S-A 매체 아로를 평평하게 만들기 위해 마운드해야 합니다. 개스킷이 없는 화염 멸균 슬라이드 중 하나를 TPM 미디어 아로 위에 비스듬히 놓습니다. 슬라이드를 비스듬히 배치하면 기포 형성을 방지하는 데 도움이 됩니다.

양쪽에 하나씩 미니 바인더 클립으로 복합체를 고정합니다. 클리핑된 복합체를 섭씨 4도에 놓고 발생한 미디어가 굳을 때까지 기다립니다. 이 작업은 일반적으로 약 5분 정도 걸립니다.

매체가 굳으면 복합체를 섭씨 4도에서 제거합니다. 바인더 클립을 제거하고 복합체의 끝을 짜십시오. 테이프로 감싼 슬라이드를 풀려면 테이프로 감싼 슬라이드를 제거하고 나중에 사용할 수 있도록 벤치에 놓으십시오.

그런 다음 한 쌍의 집게를 쐐기로 사용합니다. 지지 슬라이드에서 커버 슬립 개스킷 미디어 어그로스 복합체를 분리하고 지지 슬라이드를 폐기합니다. 커버 슬립 개스킷 복합체를 분리하기 위해 들어 올리는 동작을 사용하지 마십시오.이 경우 커버 슬립이 제동되거나 미디어가 지지 슬라이드에 달라붙을 수 있습니다.

지지 슬라이드를 제거한 후 개스킷 면이 위로 향하게 하여 테이프로 감싼 슬라이드에 커버 슬립 개스킷 미디어 에이 복합체를 놓습니다. 이 복합체를 버너 옆에 놓아 새로 노출된 미디어 아그로스 표면에서 눈에 보이는 모든 수분이 증발할 수 있도록 합니다. 미디어 아그로스를 1분 이상 건조시키지 마십시오.

이는 M Zant의 군집 행동에 영향을 미칠 수 있으므로 새로 준비된 분석 복합체에 세포를 플레이트화합니다. 커버 슬립 개스킷 매체에서 과도한 수분이 증발하면 그로스 복합체는 농축 세포의 0.5 마이크로 리터를 흡입하여 매체에 증착합니다. 에어로스는 미디어 아그로에 접근하기 전에 피펫 팁을 누릅니다.

파이펫 팁 하단에 세포 한 방울이 나타나 팁이 미디어 어그로에 닿지 않고 세포를 쉽게 증착할 수 있습니다. 아그로스 표면의 함몰은 mz 떼의 행동을 바꿀 수 있습니다. 피펫을 똑바로 아래로 움직여 내장된 영양 디스크에서 약 1mm 떨어진 곳에 세포를 분주합니다.

그런 다음 피펫을 똑바로 다시 위로 당깁니다. 이런 식으로 떼가 원형임을 확인할 수 있습니다. 세포가 침전되면 복합체를 버너 옆에 놓아 세포 얼룩이 20초 이상 건조되지 않도록 합니다.

건조 후 콤플렉스 바닥을 형성하는 슬라이드 개스킷 어셈블리를 덮개의 개스킷과 정렬합니다. 슬립 개스킷 매체 acro cell complex는 복합체의 상부를 형성합니다. 부드럽게 눌러 밀봉을 형성합니다.

커버 슬립의 슬라이드 표면을 김 물티슈로 청소하여 결로 현상을 방지하기 위해 잔여물을 제거합니다. 슬라이드를 청소한 직후 가열된 현미경 스테이지에 복합체를 놓고 슬라이드를 내리고 덮개를 위로 밀어 넣습니다. 결로가 형성된 경우 이미지 획득 소프트웨어를 시작하기 전에 슬라이드 콤플렉스를 가열된 스테이지에 몇 초 동안 두십시오.

동영상을 준비하려면 현미경에서 2 x 4 x 또는 10 x 중 적절한 대물렌즈를 선택하십시오. 카메라와 현미경을 켜고 광도를 확인하여 빛이 너무 강하지 않은지 확인합니다. 컴퓨터를 시작하고 이미지 획득 프로그램을 엽니다.

라이브 이미지 창을 클릭하고 현미경의 초점을 맞춥니다. 이미지는 여기에 표시된 것과 비슷하게 나타납니다. 이미지 획득을 시작합니다.

미디어 한천이 가라앉는 경향이 있어 초점이 표류하는 경향이 있으므로 처음 한 시간 동안은 정기적으로 초점을 확인하십시오. 이미지 획득이 완료되면 획득한 이미지를 저장하기 위해 전송합니다. 하룻밤 동안 90% 에탄올을 담그거나 재사용을 위해 개스킷을 TOLA하여 슬라이드 복합체를 분해합니다.

이 타임랩스 동영상은 여기에 설명된 추적 분석의 적용을 받는 것을 보여줍니다. 캡처 속도는 20 배 배율에서 분당 1 장, 재생 속도는 초당 60 장입니다. 이 시간 경과 영화는 세포의 1%가 GFP를 표현하고 있는 eant의 집단을 보여줍니다.

이 영화는 위상차와 형광 이미지를 번갈아 가며 병합하여 편집되었습니다. 분석은 C-T-T-Y-E에서 1%Aros 캡처 속도로 수행되었으며 100x의 배율로 분당 1개의 이미지입니다. 이 타임랩스 영상은 M Anthes의 활공 운동성을 보여줍니다.

이 분석은 C-T-T-Y-E에서 1%Aros 캡처 속도에서 100배 배율에서 분당 1개의 이미지입니다. 이 타임랩스 영상은 P OSA의 경련 운동성을 보여줍니다. 이 분석은 1%Aros 캡처 속도가 분당 하나의 이미지인 LB에서 수행되었습니다.

20배 배율에서 재생 속도는 초당 60장입니다. 이 타임랩스 영상은 스마르가 떼지어 몰려드는 움직임을 감지하는 것을 보여준다. 이 분석은 LB에서 수행되었으며 1% Aris 캡처 속도는 분당 하나의 이미지입니다.

20배 배율에서 재생 속도는 초당 60장입니다. 이 타임랩스 동영상은 EGT 슬라이딩 운동성을 보여줍니다. 이 분석은 0.5%의 LB에서 수행되었으며, 태그 로즈 캡처 속도는 분당 1개의 이미지이며, 20배 재생 속도의 배율은 초당 120개의 이미지이므로 0.5%의 취약성이 lv에서 발생했습니다.

이 분석실험은 숫자 1 B.We.We에서 보인 더 큰 틈막의 사용을 이용합니다 당신에게 세균성 biofilms의 시간 경과 영화를 생성하는 방법을 보여주었습니다. 이 절차를 수행할 때. 일관된 결과를 얻기 위해 시간을 갖고 가능한 한 정확해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.