Name: 의 분리를위한 방법 Francisella tularensis 아웃터 세포막 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-29T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 배우세요 Francisella tularensis의 외막 소포를 삼투압 용해와 초원심 분리를 통해 분리하는 방법을. 이 기술은 세균 병원성 연구와 백신 개발에 활용됩니다.

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설명이 프로젝트는 부여 번호 NIAID / NIH에서 P01 AI055637와 U54 AI057156 지원했다. 그 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 경찰과 프로그램 사무실, NIAID, 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

1 일 : F. tularensis 플레이트 접종 <ol><li> F.의 플레이트 냉동 재고 문화 뮬러 - 힌턴 한천에 tularensis 2.5 % (권 / 권) 기증자 송아지 혈청, 2 % (권 / 권) IsoVitaleX, 0.1 % (WT / 권) 포도당, 그리고 0.025 % (WT / 권) 철 나트륨과 보충. F. 그로 ° C 5 % CO 2와 함께 약 24 H. 위해 37 tularensis </li></ol> 일 2 : F. tularensis 액체 미디어 접종 <ol><li> 양이온 - 조정 뮬러 - 힌턴 매체 (1.23 MM의 염화칼슘 이수화물 및 1.03 MM의 마그네슘 염화 hexahydrate을 포함) 1 리터 준비하고 압력솥. 37 냉각하면 ° C, 0.1 % (WT / 권) 포도당, 0.025 % (WT / 권) 철 나트륨, 2 % (권 / 권) IsoVitaleX 대한 추가 보완 매체. 이 500 ML의 aliquots로 (0.22 μ) 소독 매체를 필터링합니다. </li><li> 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 보충 뮬러 - 힌턴 매체 및 전송 12 ML를 제거합니다. </li><li> 멸균 10 μl 접종 루프를 사용하여, F.의 큰 loopful을 다쳤어요 뮬러 - 힌턴 중간 (단계 2 참조) 12 ML에 한천 플레이트 (1 일 이상) 및 전송 박테리아에서 tularensis 성장. 피펫 솔루션을 여러 번 대단히 짧은 시간을 헤어지게하고 동질적인 박테리아 정지를 준비합니다. 와동하지 마십시오. </li><li> 멸균 피펫을 사용하여 3 단계에서 세균 현탁액의 5 ML 각 500 ML 선박의 예방. 37 국물 문화를 성장 ° C 부드러운 흔들림 (뉴 브 런 즈윅 이노바 2300 시리즈 쉐이크에 190-200 RPM)를 14-18 H하십시오. </li></ol> 3 일 : Spheroplasting, 삼투 용해 및 자당 농도 구배 원심 분리 <ol><li> F.를 구합니다 tularensis의 흔들림이 인큐베이터에서 문화는 각각의 광학 밀도를 확인 각 500 ML 문화 1 - ML 나누어지는를 제거합니다. F.를 사용할 때 우리는 최적의 멤브레인 추출 및 절연 결과를 발견 0.2 사이 0.4 (~ 10월 7일에서 10월 8일까지 CFU / ML)로 OD 600과 상호 성장의 초기 단계에 로그 tularensis 세포. 0.2 이상의 OD 600 적은 비용으로 문화는 이후 자당의 그라디언트에 대한 총 멤브레인 소재의 충분한 수량을 얻을 수 없습니다. 반대로, 0.4 (고정 단계를 근접)보다 OD 600 이상과 문화가 혼합 막 fusions를 얻을 것으로되었습니다. </li><li> 15 30 분 7,500 X g에서 문화를 원심 분리기 ° C는 세포를 수집합니다. 그것이 이후 펠렛 서스펜션을 용이하게하기 때문에 우리는, 넷 250 ML의 원심 분리기 병의 문화의 원심 분리하는 것이 좋습니다. </li><li> 조심스럽게 각 원심 분리기 병에서 미디어 표면에 뜨는를 제거하고 단단히 초과 성장 매체를 제거하는 흡착제에 병을 누릅니다. </li><li> 원심 분리의 10 분 이내에 다음과 같은 완성, 0.75 M의 자당 (5 MM 트리스, 산도 7.5의)의 8.75 ML 각 박테리아 펠렛을 일시 중지합니다. 이들 네 박테리아 쥐똥이 일시 중지하고 10 분 이내에 살균 250 ML 플라스크 (작은 stirbar로)로 (세균성 정지 35 ML 총) 양도해야합니다. </li><li> 부드럽게 stirplate에 세포 현탁액을 혼합하는 동안, 천천히 10 분 과정 10여 MM 나트륨 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 70 ML (2 볼륨) (5 MM 트리스, 산도 7.8)을 추가합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 높은 지방 농도를 피하기 위해 세포 현탁액 수준 아래 피펫의 끝에있는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가합니다. stirbar 철저하게 얼굴이 볼만 또는 버블 형성 원인만큼 빠른 세포 현탁액을 혼합 아니라 충분한 속도로 회전해야합니다. EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션이 추가되었습니다 후, 실온에서 30 분 솔루션을 품어. </li><li> 30 분 부화 후, 천천히 200 μg / ML의 최종 농도 2 MG / ML 라이 소 자임 솔루션 11 ML (1 / 10 일 볼륨)을 추가합니다. 라이 소 자임 솔루션뿐만 동안 세포 현탁액을 섞어 계속합니다. 위에서 바와 같이, 라이 소 자임의 높은 지방 농도를 피하기 위해 세포 현탁액 유체 수준 아래에 피펫 팁과 라이 소 자임 솔루션을 추가합니다. 주식 라이 소 자임 솔루션 (2 MG / ML) 단일 사용 aliquots에서 준비하고 3~4개월위한 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 실온에서 30 분 결과 솔루션을 품어. </li><li> 30 분 동안 부화, 작은 stirbar 룸 온도 Cellgro 분자 학년 DH 2 O (4.5 권)의 530 ML과 멸균 1L 플라스크를 준비합니다. </li><li> Osmotically 부드러운 혼합과 10-15 분 과정을 통해 분자 학년 DH 2 O (7 단계에서)의 530 ML에 느린 희석 (약 11 ML / 분 유량)의 세포 현탁액을 (6 단계에서) lyse. 때문에이 단계에서 큰 솔루션 볼륨의 적절한 혼합을 보장하기 위해 stirbar 속도를 향상시킬 수 있습니다. stirbar 얼굴이 볼만 또는 버블 형성으로 이어질 정도로 빠르게하지 철저하게 세포 현탁액을 분산하기 위해 충분한 한번 DH 2 O에 추가 속도로 회전하지만해야합니다. 셀의 균일한 희석을 촉진하기 위하여, 피펫의 끝은 stirbar에 인접한 술병의 바닥에 휴식과 세포 현탁액을 추가내 현탁액. 우리는 25 - ML의 pipettes이 단계에서 가장 잘 작동 것으로 나타났습니다. 조심스럽게 희석 과정을 모니터하고 유속 세포, 세포 대단히 짧은 시간, 그리고 세포 가닥의 로컬 쌓일 해산하기 위해 필요를 방해. 실온에서 30 분 결과 솔루션을 품어. 이 단계가 가장 도전적이고 실험의 전반적인 성공에 중요한 중 하나 나타납니다. </li><li> 30 분 부화 후 10시 30 분 7500 XG 50 - ML 원뿔 튜브와 원심 분리기로 삼투 용해 용액 40 ML aliquots를 전송 ° C가 그대로 세포와 이물질을 제거합니다. </li><li> 원심 분리 후, 조심스럽게 멸균 1L 플라스크에 각 원뿔 관 및 수영장 supernatants에서 뜨는의 27-30 ML을 제거 </li><li> 4 2 H에 대한 200,000 X G (F50L - 8x39 FiberLite의 초원 심 분리기의 회전자에 44,400 RPM) ° C. 16 초원 심 분리기 튜브와 원심 분리기로, 각각 풀링 뜨는 25 ML을 전송 각 로​​터 8 튜브를 보유하고 있습니다,이 단계 두 로터 두 ultracentrifuges 필요하므로. 또한, 8 튜브의 두 번째 세트 centrifuged ° C까지 4에서 개최한다. </li><li> 초원 심 분리기 실행의 완성 10 분 이내에 멤브레인 resuspension 버퍼를 수정할 준비를합니다. 멸균 튜브에 막 중지 버퍼 8 ML (25 % [WT / WT] 자당, 5 MM 트리스, 30 MM MgCl 2) 전송 및 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 테아제 억제제 칵테일과 Benzonase의 375 U 1 타블렛을 추가합니다. 부드럽게 테아제 억제제의 정제를 해산하기 위해 솔루션을 섞는다. </li><li> ultracentrifugation에 따라 신중하게, supernatants를 부어 흡착제에 초원 심 분리기 튜브를 반전하고, 단단히 초과 뜨는을 제거하기 위해 튜브를 누릅니다. 시각화에 도움을 마커 각 막 펠렛의 위치를​​ 표시합니다. 부드럽게 600 μl 수정 막 resuspension 버퍼의 각의 8 멤브레인 알약을 resuspend. 부드럽게 멸균 튜브에이 여덟 산탄, 그리고 수영장 결과 멤브레인 resuspensions을 resuspend 여덟 튜브의 다음 세트 각 막 resuspension을 전송합니다. 그것이 멀리 튜브의 벽에서 필스 때까지 pelleted 점막이 resuspend하기 어려운되므로, 펠렛을 통해 수정된 막 resuspension 버퍼를 통과 계속합니다. 그것은 종종 resuspension 과정에서 튜브 벽 및 원조에서 멤브레인 펠렛를 긁어 micropipette 팁을 사용해야합니다. pipetting 때, 얼굴이 볼만 피하거나 거품이 형성. 이 단계가 가장 도전적이고 실험의 전반적인 성공에 중요한 중 하나 나타납니다. </li><li> 멤브레인 알약이 resuspended 모든 16 튜브에서 제거된 경우, 수정된 멤브레인 resuspension 버퍼 600 μl와 매 4 튜브를 씻으십시오. 세척은 각 튜브의 표시 영역 (막 펠렛) 주변에 집중해야합니다. 막 resuspension 튜브로 세척을 전송합니다. 네 튜브의 나머지 세 세트를위한 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 응집 물질의 감소에 DNA와 도움을 손상시키고 실온에서 30 분 부드러운 락을 함께 막 resuspension을 품어. </li><li> 막 현탁액의 작은 나누어지는을 제거하고 전체 멤브레인 수율을 결정하는 단백질 부량을 수행합니다. 우리는 일반적으로 undiluted 준비, 1:1 (2.5 % SDS)을 희석하고, 1시 3분 90시 (2.5 % SDS)를 막 샘플, 열 샘플을 희석 ° 10 분, 그리고 수치 BioRad DC의 단백질 분석을 사용하기 위해 C 막 resuspension 단백질 농도. 총 단백질 수율 1.0 MG / ML 1.6 MG / ML 사이에 일반적으로있다. 열과 SDS의 사용은보다 정확한 단백질 부량 값을 얻을 수 있도록 압축이 풀린 세포막에서 OMPs을 해제해야합니다. </li><li> 55%, 50 %, 45 %, 다음 순서대로 14 X 95mm 울트라 클리어 초원 심 분리기 튜브로 겹겹이 1.8 ML 자당 솔루션의 각 (WT / WT, 5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 7.5의 준비)에 의해 선형 자당의 그라디언트 준비 40 %, 35%, 30 %. 자당의 그라디언트의 겹겹이는 전구의 pipettor 아니라 자동 pipettor를 사용할 때 수행하는 가장 쉬운 방법입니다. </li><li> 막 resuspension 단백질 양을 정함 (단계 16), 레이어의 각 그라디언트 위에 막 resuspension 1.5 MG에 따라. 각 14 X 95mm의 초원 심 분리기 튜브는 10.8 ML은 단계 17에서 자당 솔루션에 의해 차지하는 것을 주어진 최대 12.5 ML의 용량과를 가지고, 당신은 그라디언트마다 막 resuspension 이상의 1.7 ML를 로드할 수 없습니다. 모든 튜브는 (± 0.01 g) 같은 무게 때문에 각 자당 기울기 관의 마지막 무게를 (막 resuspension를 추가하거나 제거하여) 개별적으로 무게와 신중하게 조정합니다. </li><li> 4 17 H 최소 256,000 X G (38,000 RPM) ° C.에서 SW - 40Ti 스윙 버킷 로터와 원심 분리기에 자당의 그라디언트를 전송 </li></ol> 주 4 : 자당 기울기 분수 수집 <ol><li> 원심 분리 17 H 후, 원심 실행을 중지하고, 조심스럽게 SW - 40Ti의 회전자에서 자당의 그라디언트를 제거합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 자당 기울기 튜브의 아래쪽, 바늘을 조심스럽게 청소21g 바늘로 튜브의 아래쪽, 그리고 무균 microfuge 튜브에 그라디언트에서 순차 500 μl 분수를 수집합니다. 이후 그라디언트에 대한 반복합니다. 기울기가 중력의 흐름에 의해 똑 수 있어야하므로 같은 자당 기울기를 방해하지 않습니다. 흘리지는 그라디언트 튜브의 바닥에서 멈추면 경우, 압력 소량 하나의 손가락을 사용하여 튜브의 상단에 적용할 수 있습니다. </li><li> 굴절계를 사용하여 각 자당 기울기 분율의 굴절률을 결정하고 G / ML 1 특정 밀도 굴절률을 상관 관계. nitrocellulose로 전송, SDS - PAGE 분리, 그리고 immunoblotting, 대표 자당 기울기 분수 (1.11에서 G / ML 1.26 G / ML에 0.01의 밀도 증가)을 준비하여 단백질 지방화을 평가합니다. </li></ol> 대표 결과 두 종류의 메신저와 OM의 vesicles의 완전한 분리에 제대로 수행이 절차 결과 (예 : SchuS4)과 B 타입의 F. (예 : LVS) 종자 tularensis. 그림 1, F. 대표 immunoblots에 표시 tularensis의 OMPs는 1.17 및 1.20 g / ML의 밀도 사이에 집중. 비교함으로써, IMPs는 1.13 및 1.14 g / ML의 밀도 사이에 집중. <img src="/files/ftp_upload/2044/2044fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. F.의 Immunoblotting tularensis의 자당 밀도 기울기. 연속 분수는 그라디언트와 밀도 (g / ML) 굴절 지수에 기초하여 계산되었다에서 수집되었다. 단백질은 SDS - PAGE로 구분하여 nitrocellulose로 전송하고, OMP 그리고 IMP 분별 (분리)을 감지 immunoblotted했다. MW는 크기 (KDA)를 각 얼룩의 왼쪽에있는 언급과 분자량 표준을 prestained. F.의 LVS, 전체 세포 lysates tularensis의 LVS. 해당 자당 기울기 분율의 밀도는 각각의 차선 위에 설명되어 있습니다. 로 왼쪽 여백에 명시된 바와 같이 OMPs와 IMPs는, polyclonal, monospecific antisera과 함께 발견되었다. 비슷한 결과는 F.에 대한 취득했다 tularensis SchuS4.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 spheroplasting, 삼투 용해의 변화 및 기타 세포 구성 요소 2, 3, 4의 물리적 분리 및 그람 음성 세균 OMS의 농축에 대한 자당 밀도 기울기 원심 분리 &quot;금 표준&quot;을 설명합니다. 우리는 이전에 두 종류의 OMS를 분리를위한이 방법의 응용 프로그램을 설명하는 반면 F.의 A와 타입 B의 종자 tularensis 5, 프리젠 테이션은 OM 격리에 대한 자세한 최적화 절차를 제공합니다. 사실, 이것은이 치명적인 병원균의 잠재적 표면 노출과 추정 독성 요인을 식별에 중요한 발전이다. 이 절차의 중요성은 악성 타입 F.에 대한 실질적인 보호를 여유 정화 OMPs과 생쥐의 예방 접종을 보여주는 우리의 실험실에서 연구에 입증되었다 tularensis 폐 도전 6. 세균성 세포 삼투 용해 중에주의 모니터링 및 멤브레인 알약의 부드러운 resuspension의 위에 바와 같이, 성장 단계는이 막 분리 절차의 성공 / 실패와 연관시키는 것은 나타나지 중요한 단계입니다. 이 최적화 방법은 엄격한 일부 실험적인 변화에 따라 달라질 수 있지만, 결과 OMS는 세제의 사용, 염화 리튬이나 나트륨 탄산 7, 8, 9, 10, 11 얻고 사람에 비해 현저하게 향상된 순결이 될 것처럼, 12.

<table><tbody><tr><td>공여 송아지 혈청(Donor calf serum)</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>IsoVitaleX</td><td>BD Biosciences</td><td>211876</td><td></td></tr><tr><td>Cellgro 분자 생물학 등급 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>38.5 ml 폴리카보네이트 병</td><td>FiberLite</td><td>010-0514</td><td></td></tr><tr><td>F50L-8x39 초원심분리기 로터</td><td>FiberLite</td><td>096-087051</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche Group</td><td>04693132001</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>DC 단백질 분석 키트(DC protein assay)</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear 14x95mm 원심분리 튜브</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>SW-40Ti 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>331301</td><td></td></tr><tr><td>Abbe 벤치탑 굴절계</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-964-10</td><td></td></tr></tbody></table>

의 분리를위한 방법 francisella tularensis 아웃터 세포막

Method for the Isolation of Francisella tularensis Outer Membranes

Francisella tularensis는 그람 음성 세포 coccobacillus와 zoonotic 질병 tularemia의 원인이되는 에이전트이다. 다른 세균성 병원균, 매우 낮은 전염성 선량 (&lt;10 CFU), 신속한 질병의 진행, 높은 병적 상태와 사망률 요금은 Francisella의 악성 변종이 소설 독성 요소를위한 인코딩하는 것이 좋습니다 비교하면. 표면 노출 분자, 즉 외부 멤브레인 단백질 (OMPs)은 세균의 호스트 바인딩 세포, 항목, 세포 생존, 독성 및 면역 회피을 촉진하기 위해 표시되었습니다. OMPs을 공부에 대한 관련 성은 더 이상 그들은 세균성 질병의 숫자에 대한 보호 백신으로 사용할 수있다는 사실에 의해 강조합니다. OMPs는 원심 분리 및 / 또는 세제 추출 다음 세포의 sonication을 포함한 대량 막 추출 기술을 통해 그람 음성 박테리아에서 추출 수있는 반면에, 이러한 준비는 종종 periplasmic 및 / 또는 세포질 (내부) 멤브레인 (IM) 오염 물질로 오염된 있습니다. 년 동안, 그람 음성 메​​신저와 외부 세포막의 생화​​학과 biophysical 분리의 &quot;금 표준&quot;방법 (OM) 자당 농도 구배 원심 분리에 의해 다음, spheroplasting 및 삼투 용해에 따라 박테리아되었습니다. 일단 자당 기울기에 겹쳐, OMS는 낙관적인 밀도의 차이에 따라 인스턴트 메시지에서 분리 크게 OM에서 lipopolysaccharide의 존재 (LPS)에 predicated 것으로 수 있습니다. 여기, 우리는 추출 풍부하게, 그리고 F.을 분리하기 위해 엄격한하고 최적화된 방법을 설명 tularensis 외부 세포막과 관련 OMPs.

에서 내부와 외부 세포막을 분리를위한 프로토콜<em&gt; Francisella tularensis</em&gt; spheroplasting, 삼투 용해 및 자당 밀도 기울기 ultracentrifugation에 의해.

의 분리를위한 방법 Francisella tularensis 아웃터 세포막

Francisella tularensis는 그람 음성 세포 내 코코바실러스(coccobacillus)로, 인수공통 전염병인 툴라레미아의 원인균입니다. 다른 ...와 비교했을 때

Francis Cellis 외막 소낭 및 관련 외막 단백질의 분리는 세균 세포의 삼투압 용해로부터 시작됩니다. 대수 성장기 세균을 고장성 sucrose, EDTA 및 lysozyme 용액으로 순차적으로 처리한 후 탈이온수에 천천히 희석합니다. 이렇게 생성된 세균 용해물을 저속 원심분리하여 세포 파편과 파괴되지 않은 세포를 제거한 다음, 고속 원심분리를 통해 막 소낭을 침전시킵니다.다음으로, 내막(inner membrane, IM) 소포와 외막(outer membrane, OM) 소포를 분리하기 위해 전체 막 소포를 수크로스 밀도 구배(sucrose density gradients) 위에 층을 이루게 합니다. 외막 소포는 부력 밀도의 차이를 기반으로 내막 소포와 분리할 수 있으며, 이러한 차이는 주로 외막에 존재하는 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)에 기인하는 것으로 알려져 있습니다. 수크로스 밀도 구배의 연속적인 분획들에 대해 면역 블롯팅을 실시하면 내막 단백질과 외막 단백질이 공간적으로 분리되어 있음을 확인할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 UT Southwestern Medical Center at Dallas 미생물학과의 Michael Norgaard 박사이며, 여기는 Jason Huntley 박사입니다.오늘은 Huntley 박사님이 France cellis의 외막과 그에 결합된 막 단백질을 추출, 농축 및 분리하는 절차를 보여드릴 것입니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 통해 이 세포 내 세균 병원체의 외막에 위치하며 잠재적으로 표면에 노출된 분자들을 연구합니다. 일정이 바쁘니 바로 시작하겠습니다.이 절차를 시작하려면, 동봉된 서면 프로토콜에 설명된 대로 FCIs 박테리아 배양액 500 milliliter 두 개를 준비하고 배양하십시오. 진탕 배양기에서 박테리아 배양액을 꺼내고, OD 측정을 위해 각 배양액에서 1 milliliter의 Eloqua를 취하여 성장 초기 대수기(OD 600 기준 0.2에서 0.4 사이)의 lorenza 세포를 확인하십시오. 배양액이 원하는 OD 600 값에 도달했을 때 막 추출 및 분리 결과가 최적화됩니다.네 개의 250 milliliter 원심분리 병을 사용하여, 세포를 수집하기 위해 배양액을 15 °C에서 7,500 Gs로 30분간 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 각 원심분리 병에서 배지 상층액을 조심스럽게 제거하고, 흡수성 재질 위에 병을 가볍게 두드려 남은 성장 배지를 제거합니다. 원심분리 완료 후 10분 이내에, 각 박테리아 펠렛을 5 millimolar triss pH 7.5에 포함된 8.75 milliliters의 0.75 molar sucrose에 현탁시킵니다.각 펠렛을 현탁시킨 후, 용액을 작은 교반 바가 들어 있는 멸균된 250 milliliter 플라스크로 옮깁니다. 나머지 4개 박테리아 펠렛 모두에 대해 이 과정을 반복하여, 최종 박테리아 펠렛 현탁액의 총량이 35 milliliters가 되도록 합니다. 세포 현탁액을 교반 플레이트 위에서 충분히 혼합하되, 너무 빠르게 섞지 마십시오.천천히 혼합하는 동안 거품이나 기포가 생기는 것을 방지하기 위해, 10분 동안 10 millimolar EDTA 70 milliliters를 용액에 천천히 첨가합니다. EDTA의 국소 농도가 높아지는 것을 방지하기 위해 피펫 팁을 세포 현탁액 수면 아래에 유지하십시오. EDTA를 첨가한 후, 용액을 실온에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 천천히 계속 혼합하면서, 최종 농도가 200 µg/mL가 되도록 2 mg/mL lysozyme 용액 11 mL를 첨가합니다. lysozyme 용액을 첨가하는 동안 세포 현탁액을 계속 혼합하십시오. 이전과 마찬가지로 팁을 세포 현탁액 수위 아래에 유지하십시오.세포를 라이소자임과 함께 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양하는 동안, 작은 스터 바와 실온의 세포 성장 분자 등급 탈이온수 530 milliliters가 담긴 멸균된 1리터 플라스크를 준비합니다.세포 배양이 완료되면 25 mL 피펫을 사용하여 플라스크 바닥의 교반 바 옆에 가라앉은 삼투압 용해 세포 현탁액을 흡입하고, 10~15분에 걸쳐 1L 플라스크 내의 물에 천천히 희석하며 부드럽게 혼합합니다. 이 단계는 까다로우며 실험의 전반적인 성공에 매우 중요합니다. 교반 속도는 세포 현탁액을 완전히 분산시킬 수 있을 만큼 충분히 빨라야 하지만, 거품이나 기포가 형성되지 않도록 적절히 조절해야 합니다.적절한 혼합을 위해 교반봉의 속도를 천천히 높입니다. 희석 과정을 주의 깊게 모니터링하고, 세포의 국소적 축적, 세포 덩어리 및 세포 가닥을 분산시키기 위해 필요에 따라 유량을 조절하거나 플라스크를 회전시킵니다. 모든 세포를 첨가한 후, 상온에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다. 배양이 끝나면 삼투압 용해액 40 milliliter씩을 50 milliliter 원심분리관(conical tubes)에 옮기고 10 degrees Celsius에서 7,500 Gs로 30분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 온전한 세포와 잔해물을 제거하기 위해, 각 원뿔형 튜브에서 상층액 27~30 mL를 조심스럽게 취해 멸균된 1 L 플라스크에 모읍니다. 모아둔 상층액 25 mL를 16개의 초원심분리 튜브에 각각 옮기고, 4 °C에서 200,000 Gs로 2시간 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되기 10분 전까지 수행합니다.변형된 막 재현탁 현탁 완충액을 준비합니다. 멸균 튜브에 8 mL의 막 현탁 완충액, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일 1정, 375 units의 Benzonase를 혼합하고, 용해된 세포를 원심분리한 후 부드럽게 섞어줍니다. 이어서 막 펠렛을 회수합니다.용해된 세포의 초원심분리가 완료되면, 상청액을 조심스럽게 따라낸 다음 튜브를 흡수제 쪽으로 뒤집어 단단히 두드립니다. 과잉 상청액을 제거하기 위해, 시각적 확인을 돕도록 각 막 펠렛(membrane pellet)의 위치를 마커로 표시합니다. 8개의 막 펠렛을 각각 600 µL의 변형된 막 재현탁 완충액(modified membrane resus suspension buffer)으로 부드럽게 재현탁합니다.막 펠렛(membrane pellet)을 재현탁하는 것은 어렵습니다. 따라서 수정된 막 재현탁 완충액(modified membrane Resus suspension Buffer)을 펠렛 위로 조심스럽게 계속 흘려보내어, 펠렛이 튜브 벽면에서 떨어져 나오게 하십시오. 이 단계는 매우 까다로우며 실험의 전반적인 성공을 결정짓는 중요한 과정입니다.필요한 경우, 마이크로 파이펫 팁을 사용하여 튜브 벽에서 막 펠릿(membrane pellet)을 긁어내십시오. 파이펫팅 시 거품이 생기지 않도록 주의하십시오. 과도한 전단력은 혼합 미셀(mixed my cell) 형성을 유발하여 막 분리를 방해합니다. 각 막 재현탁액(membrane resus suspension)을 다음 8개의 튜브 세트로 옮기십시오.남은 펠릿을 부드럽게 재현탁하고 모든 현탁액을 멸균 튜브에 모읍니다. 16개 튜브 모두에서 막 펠릿을 제거한 후, 튜브 4개마다 600 µL의 modified membrane Resus suspension buffer로 세척합니다. 각 튜브의 표시된 영역을 중심으로 세척하고, 세척액을 재현탁된 막과 합칩니다.나머지 튜브들에 대해서도 세척 과정을 반복합니다. DNA를 분해하고 응집성 물질의 감소를 돕기 위해, 멤브레인 재현탁액을 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들어 잉큐베이션합니다. 다음으로, 멤브레인 현탁액의 소량을 취해 단백질 정량을 수행합니다.총 막 수율을 결정하기 위해, 2.5% SDS 내에서 막 현탁액을 1:1 및 1:3으로 희석하여 준비한 후, 희석하지 않은 1:1 및 1:3 막 현탁액을 90 °C에서 10분 동안 가열합니다. 추출된 막에서 O MPS를 방출시키기 위해서는 SDS와 가열 과정이 필요합니다. BioRad DC 단백질 분석법을 사용하여 막 재현탁액의 단백질 농도를 정량합니다.총 단백질 수율은 일반적으로 1~1.6 mg/mL 사이입니다. 막 조제물의 단백질 농도가 결정되면, 샘플을 자당 밀도 구배(sucrose gradient)로 분리할 수 있습니다. 먼저 EDTA가 포함된 일련의 자당 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오.선형 수크로스 밀도 구배를 준비하려면, 벌브 피펫터를 사용하여 14 by 95 millimeter UltraClear 초원심분리 튜브에 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30% 순서로 각 수크로스 용액 1.8 milliliters를 층층이 쌓습니다. 다음으로 각 구배 위에 1.5 milligrams의 막 재현탁액을 층으로 올립니다. 구배당 막 재현탁액을 1.7 milliliters 이상 로딩하지 마십시오. 각 튜브의 무게를 개별적으로 측정하고, 막 재현탁액을 추가하거나 제거하여 모든 튜브의 무게가 동일해지도록 최종 무게를 정밀하게 조정합니다. 수크로스 구배를 SW 40 TI 스윙 버킷 로터로 옮긴 후 4 °C에서 최소 17시간 동안 256,000 GS로 원심분리합니다.17시간 동안 원심분리를 수행한 후, 원심분리를 중단하고 로터에서 수크로스 밀도 구배 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다. 그다음, 분획물을 수집합니다. 수크로스 밀도 구배 튜브의 바닥 부분을 70% ethanol로 조심스럽게 닦아냅니다.그런 다음 21 gauge 바늘로 튜브 바닥을 뚫고, 그래디언트로부터 500 µL씩 순차적으로 분획하여 멸균된 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. sucrose 그래디언트가 흐트러지지 않도록 그래디언트 용액이 중력에 의해 자연스럽게 떨어지도록 해야 합니다. 다만, 그래디언트 튜브 바닥에서 용액이 더 이상 떨어지지 않을 경우, 손가락을 사용하여 튜브 상단에 약간의 압력을 가해도 좋습니다.마지막으로, 굴절계(refractometer)를 사용하여 각 sucrose gradient 분획의 굴절률을 결정하고, 굴절률을 g/mL 단위의 특정 밀도와 상관 분석합니다. SDS page 분리 및 immuno blotting을 통해 대표적인 sucrose gradient 분획의 단백질 국소화를 평가합니다. 다음은 용해된 Freis 생백신 균주에서 추출한 막을 분리하는 데 사용된 sucrose gradient 분획의 immuno blot으로, Freis 외막 단백질(outer membrane proteins 또는 OMPs)이 1.17 및 1.2 g/mL 밀도 사이에 국소화되어 있음을 보여줍니다.이와 대조적으로, 내막 단백질 또는 ip는 1.13에서 1.14 g/mL 사이의 밀도에 국한되어 나타났습니다. FHU 4 균주에서도 유사한 결과가 얻어졌습니다. 지금까지 삼투압 용해와 sucrose 밀도 구배 초원심분리를 통해 Francis Cellis 외막 소낭을 추출하고 분리하는 방법을 시연하였습니다.이 절차를 수행할 때, 박테리아 세포가 성장 초기 대수 증식기에 있을 때 사용해야 한다는 점과 삼투압 글라이코 단계 동안 해당 박테리아 세포를 탈이온수에 천천히 그러나 일정하게 희석해야 한다는 점, 그리고 초원심분리막 펠렛을 재현탁할 때 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이것으로 막 분리 절차를 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 앞으로의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Cian, M. B. et. al., Acinetobacter baumannii에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 세포 외피를 내막 및 외막 분획으로 분리. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 자당 구배 초원심분리를 사용하여 그람 음성 박테리아의 내막 및 외막 분획을 분리하는 방법을 보여줍니다. 멤브레인 분획은 멤브레인 특정 성분의 표적 분석을 위해 정제 및 저온에서 저장됩니다.

그람 음성 박테리아의 내막 및 외막 분획의 분리

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: 융, A. L. 외 레지오넬라 폐기구 의 외막 소포: 대식세포에서의 염증 촉진 잠재력의 분리 및 분석. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 순차적 원심분리, 멸균 여과, 초원심분리를 통해 레지오넬라 폐포 균으로부터 외막 소포(OMVs)를 분리하는 과정을 시연합니다. 정제된 OMVs는 막 단백질과 지다당류가 풍부하여 숙주-병원체 상호작용 연구에 적합합니다.

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의 분리를위한 방법 Francisella tularensis 아웃터 세포막

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