Name: 마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 배우세요 초음파 유도 마이크로인젝션 기법을 사용하여 마우스 태아 뇌에 레트로바이러스 벡터를 전달하는 방법을. 이 기술은 신경발생 전 유전자 발현 조절 및 뇌 발달 연구에 활용됩니다.

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1 부. 외과 영역 준비 <ol><li> biohazardous 시약 (예 : retroviral 벡터)와 함께 일하고있다면, 수술은 Biosafety II 캐비닛 (BSC) 안에서 수행되어야합니다. 초음파 후방 산란 현미경 (UBM)는 BSC 안에있는 변환기와 BSC 옆에 앉아 있고, 특별히 고안된 수술 무대에서 모터 제어 지원이 장소에서 개최한다. 동영상에 표시된 무대를 구축하는 데 필요한 구성 요소는 라인에 나열되어 있습니다. 이 목록은 함께 여러 각도 (요청시 제공)에서 무대의 영상과 건설을 허용해야합니다. </li><li> 개복술의 열고 닫는 (복강은 내장에 대한 액세스를 허용하는 열 절단되는 수술)은 일반적으로 플라스틱 뒷면과 흡수 패드에 수행됩니다. 전에 수술에 필요한 도구 (예 : 면도기는, 외과 가위, 집게, 로드된 autoclip applier 등) 및 자료 (예 : PBS, 봉합, 마취, 마우스 홀더 및 overlying 판 등) 소독과에 배치해야합니다 모든 외과 영역입니다. 절개가 열려있는 시간을 제한하는 것은 수술의 성공 가능성을 극대화하는 것이 중요합니다. 모든 동물의 처리는 메가바이트 - 10 솔루션 또는 동등한와 소독되었습니다 장갑과 함께 수행한다. 글러브 멸균 것을 보장하기 위해 필요에 따라 반복 소독을 실시하여야한다. </li></ol> 2 부. 마우스 아나스타샤 <ol><li> 한 부분 Nembutal (50 MG / ML pentobarbital) PBS에서 25 MG / ML 마그네슘 황산을 살균 필터 4 부품을 포함하고있는 마취 솔루션으로 1 CC의 주사기를 채우십시오. 이것은 10 MG / MG / ML 마그네슘 황산 pentobarbital 20 ML있는 솔루션에 발생합니다. 각 마우스가 개별적으로 가중치와 bodyweight의 pentobarbital 당 kg의 90 밀리그램을 주사해야합니다 (예, 28 GM 마우스는 250 μL로 주입됩니다.) </li><li> 피부와 복부 근육을 모두 관통 배아 일 (E) 9.5에서 임신 마우스의 복부 (intraperitoneal, IP) (필요에 따라 다른 연령대를 사용할 수 있습니다)에 주입. 마우스에 대한 8~12분이 아닌 응답이 될 수 있습니다. 적절한 마취는 동물의 편안한 자세로 확인하고, 꼬리와 발가락 핀치스에 대한 응답으로 운동 부족합니다. 부드럽게 손가락 사이에 못을 곤란하게하는 것은 매우 민감하고, 그러한 곤란 어떤 응답의 부족은 동물이 충분히 anesthetized을 나타냅니다. 꼬리와 발가락 핀치스 완전히 응답받는 동물은 몇 시간이 초기 수술 절개에 대한 응답으로 약간 떨리는 수도 있습니다. 그러나, 이것은 재귀 응답하고 부적 절한 마취를 나타내는하지 않습니다. 석유 기반 안과 밤은 수술 도중에 건조하지 않도록 마우스의 눈을에 적용해야합니다. </li><li> 마우스가 anesthetized되기 위해 기다리는 동안 수술 영역과 초음파 기계 설정합니다. 레트로 바이러스 또는 lentivirus의 사용이 필요로하기 때문에 같은 바이러스 주사 상기 ​​BSL2 봉쇄는 Biosafety II 내각에서 수행되어야합니다. 또한, 바이러스에 접촉 들어오는 모든 솔루션 및 일회용 재료는 10 % 표백제 솔루션 소독해야합니다. 수술 도구와 초음파 장비 등 메가바이트 - 10 (같은 살균제로 치료해야 <a href="http://www.quiplabs.com/mb10.htm">http://www.quiplabs.com/mb10.htm</a> ) 또는 해당 시설에서 사용 동등한. </li></ol> 부 3. 태아의 노출 <ol><li> 가능하다면 (주어진 동물 시설 및 사용 가능한 공간의 제약에 따라) 그것은 외과 영역에서 별도의 위치에 수술 준비 영역을 가지고 좋습니다. 이것은 동물 사이의 교차 오염 가능성을 최소화합니다. 수술을 시작하려면, 살균 흡착제 표면에의 다시에 동물을 배치하고 70 % 에탄올로 철저하게 복부 영역을 씻으십시오. 더 광범위한 presurgical 치료는 (Betadine의 예, 연속 라운드 및 70 % 에탄올 세척) 고용하지만, 우리의 경험이 쥐 생존 수술의이 유형을 위해 필요하지 않습니다 수 있습니다. 더블 에지 면도날을 사용하여 약 1 인치 와이드 및 1.5 인치 길이의 영역에있는 복부의 머리를 면도. 약 45 ° 각도에서 면도칼로 짧은 빠른 동작을 사용합니다. 이것은 외과 영역이 적절한 치료를하는 것이 중요하지만, 과도한 젖음의 대상이 아니라, 이것이 동물의 불필요한 냉각을 초래할 수있는, 그리고 아마도 심지어는 저체온증. </li><li> 미세 수술 가위를 사용하면 동물 (두 번째 절개 도움이됩니다 결합 조직을 통해 절단 근육으로 피부를 유지)의 복부 근육을 통해 다음 먼저 피부를 통해 1 "세로 절개를합니다. 참고하는 절차를 관리 전반에 걸쳐해야합니다 수술 도구 살균 유지하고, 필요에 따라 툴팁이 아닌 인트와 접촉하는 경우 살균제와 치료 (예을 수행한다고 확신로 이동합니다) 자료를 성나게하다. </li><li> 사용 포셉 신중하게 자궁 뿔을을 그리기, 그리고 양쪽에 배아의 수를 기록합니다. 동물로 다시 자궁 뿔의 대부분이 인접한 노출된 배아 (두 양쪽에 구성에 따라 달라집니다 중 선택), 자리를 떠나있는 동안. 어머니가 그녀의 뒷면에 남아있는 동안,이 맥락에서 두 개의 배아가 주어진 시간에 노출되고 PBS에서 목욕. </li><li> 그것이 수술 (Figure1A) 동안 거기에있을 것이다 플렉시 글라스 홀더로의 뒷면에있는 동물을 플레이스 *. 다음, 녹색 silastic 멤브레인 (L RTV 실리콘 고무베이스를 사용했고,을 통해 약간 위치 포셉 한 쌍의과 함께 아래의 어머니 이상 (사용하기 전에 메가바이트 - 10로 소독한다) 10cm 조직 문화 요리 **을 낮출 에이전트를 치료, 다우 코닝 - 제품 번호는 각각 3,142,761과 2,156,946). 당신은 동물을 통해 번호판을 아래로 내려가서로 주입하는 두 태아의 자궁 조직을 그립에 포셉를 사용하고 부드럽게 세포막을 통해 그들을 가져옵니다. 동시에, 접시가 완전히 홀더에 넣어 져서, 그리고 압정을 제자리에 고정에 적용됩니다. 사전 예열 (37 ° C) PBS가 다음 완전히 배아를 커버하기 위해 요리에 추가됩니다. </li><li> 이번에는 질 벽에 (Figure1B)를 통해 노출된 태아의 실시간 영상을 만들 수있는 초음파 프로브 (Figure1A)에서 동물과 노출된 태아가 들어있는 사출 단계를 놓습니다. 프로브는 다음 직접 몇 군데있을 수있는 배아를 통해 PBS 욕조에 (전동 컨트롤을 사용하여) 저하됩니다. 탐사선이 약 2~3밀리미터 멀리 배아에서 경우 ​​이미지를 얻을 수 있습니다. 그것이 이미지를 수집하기 위해 앞뒤로 진동으로 프로브 헤드가 배아에 충돌하지 않도록하는 것은 매우 중요합니다. </li></ol> * 어머니가 수술 도중에 달려있다 홀더는 쉽게 기계 공장에서 만들 수 있습니다. 그것은 위에 접착이 플렉시 글라스의 측면과 함께 다양한 플렉시 글라스 기지, 그리고 그들 사이에 공백을 (와이드 충분히 마우스에 대한 누워있는 동안 맞게) 포함해야합니다. 양측 다음 검은색 왁스 (절개 트레이에서 예) 사람들로 가득 차 있습니다 그들의 계곡 접지 아웃을해야한다. 그 왁스 압정은 배아가 주사하는 동안 목욕을하는 PBS의 번호판을 잡아 누르면됩니다 어떤에 자료로 제공합니다. : ** 10cm 세균 요리 하단의 중심 (이것은 헤비 듀티 휴대용 펀치와 16분의 13 일 인치 원형 죽어과 함께 할 수있는 밖으로 펀치 구멍 (직경 약 2cm)해야 <a href="http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm">http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm</a> ). 또한, 센터 구멍의 양쪽 (거리 약 1.5cm)에 두 개의 작은 구멍은 불꽃 - 온수 바늘 (또는 그들이 당연히 드릴로 만든 수)로 불타게한다. 이 구멍은 다음 진공 그리스 덮여 있으며, 홀더에 접시를 보유하고있는 압정은 검은 왁스로 이겨내는 어디 것입니다. 진공 그리스 밖으로 새어에서 PBS를 방지하는 것입니다. 부 4. Microinjection 니들에 바이러스를 로딩 <ol><li> 1mm (내경)을 beveling하여 패션 microinjection 바늘은 유리가 모세 뽑아. 바늘의 날카로움은 중요하고, 충분 날카로운 바늘로 작업하는 것은 심각하게 이번에는 질 벽에과 amnionic 색의 침투를 손상 수 있으며, 실험 실패로 이어질 수 있습니다. 날카롭게 바늘은 다음 수동 주입 / 탈퇴 펌프 (다른 장치가 로딩과 바늘의 배출을 규제하기 위해 사용하지만, 이것은 무엇입니다 수에 탑재 25 μL microsyringe에 튜브를 통해 연결되어있는 피펫 홀더로 배치됩니다 ) 동영상에 표시됩니다. 최적의 대응 (공기 가득 시스템과 관련된 확장과 압축을 피하기 위해)은 microsyringe, 튜브, 그리고 바늘은 미네랄 오일로 가득해야합니다. </li><li> 이전에 바늘을 로딩하면 주사기에서 시스템에 공기 방울이 바늘 끝에 모든 방법이 없습니다 있는지 확인하십시오. 그런 다음 바이러스를로드 시작하기 전에 바늘에 작은 공기 방울 (1-2밀리미터 길이)를 다시 그립니다. 이 공기 주머니는 바이러스와 광유 사이의 분리를 유지하는 데 도움이됩니다. 주입되는 바이러스성 주가는 0.08 MG / ML의 최종 농도 (바이러스 제작에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 1, 2 참조)에서 polybrene을 포함해야합니다. titer 10 배 드롭 - 집중 retroviral 주식은 일반적으로 전염성 물질의 대부분을 포함 미립자 물질의 상당한 금액을 포함하고 그래서 5 않고 필터링 수 없습니다. 또한, 준비에 따라 바이러스 재고가 lysed 포장 세포의 게놈 DNA (특히 MLV / VSV pseudotyped 바이러스를 생성하는 293 세포를 사용하는 경우)에서 점성 수 있습니다. 바이러스의 나누어지는가 점성 경우, DNAse 소량 내가하고 주식을 느슨하게에 추가되어야하거나 바늘이 매우 어려울 것입니다 실었습니다. 바이러스 주식 (8-10 μL)의 비말은 바늘 로딩 준비 parafilm의 살균 조각에 배치해야합니다. 그런 다음, 탈퇴 펌프를 사용하여, 신중하게 나막신을 피하기 위해 바늘을 지불 관심을로드합니다. 배아에있는 바늘 또는 초음파 프로브를 휴식하지 않도록주의하고, 사출 분야에서 micromanipulator 위치에 로드된 바늘을 놓으십시오. 주사가 발생하기 전에 어떤 이유로 바늘이 상당히 로드된 경우는 주사를 시작하기 전에 제대 수있는 팁, 내부에 공기의 작은 금액을 그리는 도움이 될 수 있습니다. 이 공기 주머니는 바늘의 끝 (거의 항상 그로드 바늘 쓸모없는 렌더링합니다 사건)에서 건조 바이러스 주식으로부터 보호할 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부. 초음파 가이드 바이러스성 사출 <ol><li> 초음파 프로브 만든 실시간 이미지는 비디오 모니터에 시각이며, 배 (胚)에 microinjection 바늘을 안내하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시스템의 바이러스를 사용하는 것은 E8.5에서 amniotic 색으로 주입 또는 E9.5 - E11.5 (Figure1B)에서 amniotic 색 또는 심실 시스템 중 하나가 될 수 있습니다. 이 절차의 가장 어려운 부분이며, (탐정에 따라 50~20시간 순서)에 마스터 경험에 손이 상당히 필요합니다. 바늘 끝이 화면에 가장 밝은 장소로 초음파 이미지에 분명하고, Y 및 Z 비행기의 동력 컨트롤을 사용하여 프로브의 위치의 조정 (에 따라 움직이는 볼 수 있어야하고, X의 수동 제어 비행기). 그것은 프로브의 진동 방향은 바늘의 길이에 평행하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 바늘 끝이 배아에 주입을 위해 위치로 동작하는 동안 이미지 비행기에 남아 것을 보장합니다. </li><li> 배아는 대상 지역 (이 경우 forebrain 뇌실)을 쉽게 볼 수 있으며, 사출 경로에 자궁 물질의 최소 금액과 바늘에 액세스할 수 같은 것을 배치해야합니다. 또한, 그것은 태반을 통해 삽입하지 않는 것이 중요합니다. 대상 두뇌 영역이 바늘 발전의 방향 (micromanipulator에있는 노브를 사용하여)와 줄지어되면, 바늘은 질 벽에를 만지고해야하고 짧은 빠른 잽을 앞으로 조직을 침투해야합니다. 유사한 접근 방식은 amnionic 색 후 두뇌에 침투하는 데 사용됩니다. 바늘은 매우 날카로운 특히 경우에는 어떤 경우에는 경험이 풍부한 수사관이 한 운동의 뇌실에 충돌 수 있습니다. 프로브, 바늘, 그리고 수정란을 (무대에서 어머니를 이동하여) 이동의 역학은 연습 실습 마스터해야합니다. </li><li> 배아의 원하는 번호가 주입되면, 5.0 실크 봉합과 복벽을 닫습니다. suturing의 역학은 수술의이 유형에 특정되지 않습니다. 마지막으로, 복부 근육에 바늘을 통해 함께 주요 피부에 수의과 autoclips를 사용합니다. 마우스가 바늘을 씹어 때문에 피부를 Suturing하지 않는 것이 좋습니다. 진통제는 그것이 깨어난다로 마우스에 의해 경험 고통의 양을 줄이기 위해 절개 영역에 적용되어야합니다. 그것은 0.25 %의 Bupivacaine 솔루션 (0.8 ML / kg, 또는 2 MG / kg) 절개 사이트를 함께 subcutaneously마다 몇 mm를 주입하는 것이 좋습니다. </li><li> 마우스가 복구하는 동안 부드럽게 젤 팩 (먹이 및 수화를 촉진하기 위하여)이있는 깨끗한 새장에 흡수 종이에 동물을 믿는다. 37 슬라이드 따뜻한 설정에 케이지를 놓고 ° C 체온을 유지하기 위해. 잠에서 때, 깨끗한 새장에 마우스 젤 팩을 장소와 동물의 걸이로 돌아갑니다. </li><li> 그 다음날은 낙태를 나타내는 모든 것 중에서 어떤 질 출혈, 복부 수축, 및 / 또는 전반적인 고민 모양에 대한 마우스를 확인하십시오. 이 경우, 즉시 마우스를 안락사. 잘 손질이 머리 전체 건강한 모습은 수술의 성공적인 복구를 나타냅니다. 주입 배아는 추가 분석을 위해 embryonically 또는 postnatally 희생하실 수 있습니다. 바이러스가 인간과 같은 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (PLAP) 또는 GFP 같은 리포터 유전자를 표현하는 경우, 얼룩이 긍정적인 바이러스성 감염 (Figure1C)의 영역을 공개합니다. </li></ol> 대표 결과 주입 배아는 성인에 이르기까지 1~2일 게시물 주입 모든 방법을 희생하실 수 있습니다. 바이러스가 같은 PLAP 또는 GFP로 리포터 유전자를 표현한다면, 기자의 표현을 그 세포의 virally 감염된 세포 클론을 식별하는 역할을합니다. 예를 들어, 그림 1C에 표시된 것은 retroviral 벡터 표현 PLAP과 E9.5에서 utero에 감염 출생 후의 두뇌의 조직 섹션입니다. 감염된 세포는 histochemical 얼룩 후 보라색 클러스터로 시각입니다. virally 감염된 세포를 식별하는 것 외에도 기자 표현식 하나는 세포 형태와 위치뿐만 아니라 유전자 발현 상태를 조사 수 있습니다. NT "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2047/2047fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. E9.5 마우스 forebrain의 심실로 바이러스성 주사. A. anesthetized 동물은 사출 단계에 있습니다. 두 개의 배아는 (화살표) 표시된 초음파 프로브 아래에 노출 및 위치 것입니다. 바이러스로 가득 microinjection 바늘은 배아 근처에 위치하고 있으며 초음파 프로브와 줄지어있다. B. 화면 E9.5 마우스 배아에서 실시간으로 초음파 영상을 캡처합니다. V, 뇌실, AS, amniotic 색, UW, 자궁 벽. C.의 태아도 E10.5에서 PLAP - 표현 바이러스에 주입했다. PLAP에 대한 Histochemical 얼룩은 바이러스성 감염 이벤트의 위치를​​ 나타낸다.

<ol><li>Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+pseudotyped+retroviral+vectors+with+very+broad+host+range%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range.</a> Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).</li>
<li>Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

amniotic 색과 심실 시스템을 모두 E9.5 - E11.5에서 주입 수 있지만 초음파 가이드를 사용하여 바이러스 주사는 amniotic 색이 E8.5에서 주입 수 있습니다 E8.5 - E11.5,에서 진행하실 수 있습니다. 제대로 수행되면, 초음파지도를 사용하여 심실 시스템에 주입 바이러스 입자 따라서 forebrain (네크로 텍스, 기저 신경, diencephalon, 눈, 등), midbrain의 다양한 구조를 감염시킬 수 있습니다, 심실 시스템을 내벽 세포에 대한 액세스 권한을 가지고 그리고 hindbrain (Figure1C). amniotic 색에 주입 바이러스는 배아의 외부에있는 세포에 액세스할 수 있습니다. 바이러스 이외에 초음파 안내도 개발 배아에 세포를 주입하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서이 기술은 실험을 디자인할 때 (발달 기간, 구조, 바이러스 / 세포)에서 선택할 여러 옵션을 제공합니다. 이것은 주입된 바이러스 또는 세포가 감염 / 주입 세포 쉽게 식별 기자를 표현하는 것은 매우 중요합니다. 역사적으로, 인간 placental 알칼리성 인산 가수 분해 효소 (PLAP) 또는 GFP가 사용되었습니다. 경험에서, 우리는 PLAP histochemical과 immunohistochemical 얼룩 모두 샤프하고 뚜렷한 하나의 세포 하나가 세포 형태와 위치를 분석할 수 있도록하는 얼룩 및 clonal 분석을 수행하기 위해 수익률 때문에 PLAP은 매우 유용한 리포터 유전자 수 있습니다 나타났습니다. 바이러스성 GFP의 표현이 희미 수 있기 때문에, GFP의 기자 조직 염색법 적합하지 않을 수 있습니다,하지만 그 중 하나가 형광 활성 세포 분류 (외과)에 의해 하나의 세포를 얻기 원한다면 유용합니다.

&quot;다음 초음파 후방 산란 현미경 중 하나는 비디오에서 패러다임 - 의료의 P40을 사용했지만, P40 더 이상 상업적으로 사용할 수 없습니다.이 절차에 사용할 수 있으며, 비슷하게 가격 및 수있다 P60에 의해 대체되었습니다 동일한 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 무대 건축에 대한 설명 추가 자료 패러다임 - 의료 기기 (S)와 함께 사용할 수 있습니다. Vevo 2100 작은 동물 이미징 장비와 함께 제공됩니다. <ol><li> 패러다임 - 의료에서 P60 초음파 BioMicroscope (UBM) ( <a href="http://www.paradigm-medical.com/ubms.html">http://www.paradigm-medical.com/ubms.html</a> ). </li><li> VisualSonics에서 Vevo 2100 ( <a href="http://www.visualsonics.com/">http://www.visualsonics.com/</a> ) </li></ol> 마취 및 진통제 Nembutal 솔루션은 (pentobarbital 50 MG / ML 주사용 나트륨, 애보트 연구소에 의해 만들어진) 불터 Schein 동물 보건에서 구할 수 있습니다. 이 일정 II 제어 물질과 마약 집행 기관 (DEA)을 구하는 라이센스가 필요합니다. Bupivacaine 용액 (0.25 %, 기타 중 Hospira, 부동산에 의해 생산)은 무어 의료를 포함한 유통 업체의 숫자에서 얻을 수 있습니다.

마우스 forebrain에 초음파 유도 microinjection utero에서 e9.5에서

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

마우스에 utero 서바이벌 수술 개발하는 동안 유전자 발현의 분자 조작 수 있습니다. 이번에는 질 벽에 일찍 embryogenesis 동안 불투명이기 때문에 그러나, microinjection에 대한 배아의 특정 부분을 대상으로 능력이 크게 제한됩니다. 다행히도, 고주파 초음파 이미징 관심의 배아 지역에 microinjection 바늘 안내를 실시간으로 사용할 수있는 이미지의 생성을 허용합니다. 여기 우리는 배아 하루 마우스 forebrain의 심실 시스템 (E) 9.5에 r​​etroviral 벡터의 주사를 안내하기 위해 이미지의 사용을 설명합니다. 이 방법은 자궁 뿔에 접근하고, 그들이 몇 군데와 주입하는 동안 호수에서 목욕하는 호스트 배아를 허용 특별히 고안된 접시를 허용하는 개복술을 사용합니다. 성공적인 수술은 종종 대부분 또는 주입된 배아의 모든 관심의 후속 시점 (embryonically 또는 postnatally)에 생존의 결과. 여기에서 설명한 원칙 E8.5 태아의 amnionic 유체 (따라서 아직 해결되지 않은 신경 튜브의 앞쪽에 후부 범위 따라 감염을 허용)에 주사를 수행하기 위해 약간의 수정과 함께 사용할 수있는, 또는의 심실 시스템으로 E10.5/11.5에서 뇌. 또한, 중간 neurogenic 세 (~ E13.5)에서 초음파 영상은 바이러스 감염이나 세포 이식에 대해 특정 뇌 영역에 직접 주사를 사용할 수 있습니다. 마우스에 utero 주사에 가이드 초음파 이미징의 사용은 달리 예외적으로 어려운이 없다면 불가능하다 방식으로 마우스 배아의 분자 및 세포 조작을 허용하는 매우 강력한 기술입니다.

마우스에 utero 서바이벌 수술 개발하는 동안 유전자 발현의 분자 조작 수 있습니다. 여기 우리는 배아 하루 마우스 뇌 (E) 9.5에 r​​etroviral 벡터의 주사를 안내 고주파 초음파 이미징의 사용을 설명합니다.

마우스 Forebrain에 초음파 유도 Microinjection Utero에서 E9.5에서

마우스의 자궁 내 생존 수술은 발생 과정 중 유전자 발현의 분자적 조작을 가능하게 합니다. 하지만 자궁벽이 불투명하기 때문에...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 해당 부위에서 신경발생이 시작되기 전에 마우스 전뇌에 레트로바이러스 벡터를 전달하는 것입니다. 이 방법을 통해 생식층 세포에 관심 유전자를 형질도입시킬 수 있습니다. 또한, 이 방법을 사용하여 다른 바이러스 벡터나 세포를 주입할 수도 있습니다.이는 먼저 마취된 임신한 마우스의 개복 수술을 통해 배아에 접근함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 임신한 마우스를 초음파 트랜스듀서 아래의 주입 스테이지 위에 놓는 것입니다. 그 다음, 주입을 위해 배아를 플레이트 위에 배치합니다.절차의 세 번째 단계는 실시간 초음파 영상을 사용하여 미세주입 바늘을 주입 대상 부위로 안내하는 것입니다. 원하는 수가 채워질 때까지 배아를 순차적으로 주입합니다. 절차의 마지막 단계는 주입 장치에서 마우스를 꺼내고 체벽, 근육 및 피부의 절개 부위를 봉합하는 것입니다.그 후 동물을 회복시킵니다. 최종적으로, 조직 절편에서 특정 리포터 유전자를 검출하고 세포 유형 특이적 마커로 표지함으로써, 감염된 세포의 위치와 표현형 특성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 존스 홉킨스 대학교 의과대학 신경퇴행 프로그램의 닉 가야노(Nick Guyano) 연구실 소속 타린 피어 포이스(Taryn Pier Fois)입니다.오늘은 배아기 9.5일차 마우스 뇌의 자궁 내 레트로바이러스 벡터 미세주입을 위해 초음파 영상을 활용하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 신경 줄기세포 및 전구세포의 행동과 세포 분화 결정에 미치는 뇌 발달 단계의 유전자 발현 조절 효과를 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.주입액에 조작된 바이러스 벡터가 포함되어 있는 경우, 해당 절차는 생물안전 2등급(biosafety two) 캐비닛 내에서 수행해야 합니다. 마취된 임신한 마우스를 등으로 눕힙니다. 미세 수술 가위를 사용하여 중앙선 피부를 따라 1인치 길이로 세로 절개를 가합니다.절개 부위 주변의 피부와 근육 사이에 위치한 결합 조직을 제거하십시오. 다음으로, 포셉을 사용하여 복근을 통해 약간 더 짧게 절개하십시오. 자궁각을 조심스럽게 끌어냅니다.각 측면의 배아 수를 기록합니다. 동물을 플렉시글라스 주입 스테이지로 옮깁니다. 이는 배아를 보호하기 위함입니다.자궁각의 대부분을 동물 체내로 다시 넣고, 인접한 배아 두 개만 노출시킵니다. 배아를 촉촉하게 유지하기 위해, 작은 압정 구멍 두 개와 scholastic membrane 조각으로 밀봉된 2 cm의 중앙 구멍이 있는 10 cm 페트리 접시를 사용합니다. 핀셋 한 쌍을 scholastic membrane을 통해 약간 밀어 넣습니다.배양 접시를 모체 위로 내립니다. 접시가 내려가면, 선택한 두 배아 사이의 자궁 조직을 잡고 접시에 접종될 때 막을 통해 배아를 부드럽게 끌어당깁니다.작은 구멍을 통해 두 개의 압정을 박아 왁스에 고정합니다. 배아가 건조해지지 않도록 37 °C의 1×PBS를 접시에 채웁니다. 배아를 모체의 길이 방향과 평행하게 정렬합니다.주입 단계를 초음파 프로브 아래에 배치합니다. 배아 위로 프로브를 약 2~3mm까지 내립니다. 선명한 초음파 영상을 얻기 위해서는 프로브 헤드가 앞뒤로 진동할 때 배아와 충돌하지 않는 것이 매우 중요합니다.이미지를 수집하기 위해, 수동 주입 및 회수 펌프에 장착된 25 µL 마이크로 시린지에 바늘을 연결합니다. 비스듬히 깎여 날카롭게 다듬어진 마이크로 주입 바늘을 피펫 홀더에 배치합니다. 스톱콕 상단에 위치한 미네랄 오일이 채워진 10 cc 시린지에 가벼운 압력을 가하여 튜빙, 마이크로 주입 바늘 홀더 및 바늘로 오일을 흘려보내고, 마이크로 시린지로 오일을 흡입합니다.공기 방울이 유입되지 않도록 주의하십시오. 바늘 안으로 1~2mm 길이의 공기 방울을 끌어당깁니다. 미네랄 오일과 바이러스 용액이 섞이지 않도록, 흡입 펌프를 사용하여 바늘에 바이러스 용액을 조심스럽게 채웁니다.용액을 천천히 부드럽게 흡입하며 막힘이 발생하지 않도록 주의하십시오. 용액이 충전된 바늘을 주입 구역의 마이크로 조작기 위치에 배치하십시오. 이때 배아나 초음파 프로브에 부딪혀 바늘이 부러지지 않도록 주의하십시오.주사 바늘을 자궁벽에서 1~2 mm 떨어진 위치로 이동시킵니다. 약 45도 각도에서 초음파 프로브로 생성된 영상을 비디오 모니터로 확인합니다. 바늘 끝은 화면에서 가장 밝은 점으로 나타납니다.프로브의 진동 방향이 바늘의 길이 방향과 평행한지 확인하십시오. 비디오 모니터의 초음파 영상을 사용하여 목표 영역(이 경우 제4뇌실)이 바늘로 쉽게 보이고 접근 가능한 위치에 배아가 놓이도록 배치하십시오. 목표 뇌 영역을 바늘이 전진하는 방향과 일직선으로 맞추십시오.마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝이 자궁벽에 닿을 때까지 이동시킵니다. 바늘을 빠르게 전진시켜 자궁 조직을 관통합니다. 양막을 관통하고 배아에 적정 부피의 바이러스를 주입하기 위해 이와 같은 찌르기 동작을 여러 번 반복해야 할 수 있습니다.성공적으로 주입되면 입자성 안개가 심실로 들어가며 심실 공간이 약간 확장될 수 있습니다. 다음 배아를 주입하기 전에 바늘을 약 5mm 정도 뒤로 뺍니다. 두 배아 모두 주입이 완료되면, 포셉을 사용하여 다음 두 배아를 초성막(scholastic membrane)을 통해 끌어내고 주입된 배아를 복강 내로 되돌려 보냅니다. 원하는 수의 배아를 주입하여 복강 내로 다시 밀어 넣은 후, 마우스를 주입 스테이지에서 흡수 패드로 이동시킵니다.절개 부위를 봉합한 후, 동물을 깨끗하고 따뜻한 케이지에서 회복시키십시오. E 9.5 마우스 배아의 실시간 초음파 영상 스크린 캡처 화면은 주입 위치를 안내하는 데 사용할 수 있는 다양한 해부학적 특징을 보여줍니다. 여기서 V는 뇌실이며, 양막낭과 uw는 자궁벽입니다.주사 바늘은 이미지 오른쪽에 밝게 빛나는 부분입니다. 이 이미지에서 A-P-L-A-P를 발현하는 바이러스가 주입된 배아는 발달 중인 뇌 내에서 PLAP 양성 바이러스 감염 세포를 보여줍니다. 감염 수 주 후 리포터 발현을 통해 세포 형태와 세포 위치뿐만 아니라 클론 분석까지 확인할 수 있습니다.지금까지 배아기 9.5일(embryonic day 9.5)의 마우스 배아에 초음파 유도하 레트로바이러스 벡터 미세주입술을 수행하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 수술 중 마우스 조작 시간이 짧을수록 생존 가능성이 높아지므로 신속하게 움직이는 것이 중요합니다. 또한, 레트로바이러스 벡터와 같은 생물학적 위험 물질을 사용할 때는 각별히 주의해야 함을 기억하시기 바랍니다.여기까지입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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