Name: 어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 배우세요 미세전극배열(MEA)에서 신경망을 배양하고 기록 및 자극하는 방법을. 태아 18일 랫뇌 피질신경원을 분리하여 2~3주간 배양하면 자발적 및 자극유발 활동을 관찰할 수 있습니다.

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우리는 프로토콜에 대한 귀중한 의견을 제공 포터 그룹의 구성원을 감사드립니다. ;이 작품은 신경과 재단의 미국 아카데미에서 CMH하는 임상 연구 교육 교제, 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIGMS의 친교에 의해 투자되었다 <a href="http://www.nigms.nih.gov/">http://www.nigms.nih.gov/</a> JDR하기 (GM08169) ), NIH 국립 신경 장애 연구소에서 부여 뇌졸중 (NS054809) JDR에 루스 L. Kirschstein 내셔널 리서치 서비스 수상 (NS060392), NSF EFRI 부여 (0836017), 쿨터 재단 Translational 연구 상,와 JDR에 translational 연구 활동 (NS007480).

<ol><li>Potter, S. M., DeMarse, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+neural+cell+culture+for+long-term+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to neural cell culture for long-term studies.</a> J Neurosci Methods. 110, 1-2 (2001).</li>
<li>Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+thick+brain+slices%3A+an+interstitial+3D+microperfusion+system+for+enhanced+viability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability.</a> J Neurosci Methods. 180, 243-254 (2009).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+electrical+stimuli+shape+behavior+of+an+embodied+cortical+network+in+a+goal-directed+learning+task%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal electrical stimuli shape behavior of an embodied cortical network in a goal-directed learning task.</a> J Neural Eng. 5, 310-323 (2008).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J Neurosci. 21, 8782-8788 (2001).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Nadasdy, Z., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+dynamic+attractors+in+activity+patterns+of+cultured+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Persistent dynamic attractors in activity patterns of cultured neuronal networks.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 73, 051907-05 (2006).</li>
<li>Esposti, F., Signorini, M. G., Potter, S. M., Cerutti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+long-term+correlations+in+dissociated+cortical+neuron+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Neural+Syst+Rehabil+Eng%22%5BJournal%5D)">Statistical long-term correlations in dissociated cortical neuron recordings.</a> IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17, 364-369 (2009).</li>
<li>Madhavan, R., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+recurring+spatiotemporal+activity+patterns+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of recurring spatiotemporal activity patterns in cortical networks.</a> Phys Biol. 4, 181-193 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur J Neurosci. 28, 221-237 (2008).</li>
<li>Hofmann, F., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+recordings+with+microelectrode+arrays%3A+studies+of+transcription-dependent+neuronal+plasticity+and+axonal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Long term recordings with microelectrode arrays: studies of transcription-dependent neuronal plasticity and axonal regeneration.</a> J Physiol Paris. 99, 2-3 (2006).</li>
<li>Gortz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+reduction+of+spontaneous+neuronal+network+activity+by+sublethal+amyloid+beta+%281-42%29+peptide+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Transient reduction of spontaneous neuronal network activity by sublethal amyloid beta (1-42) peptide concentrations.</a> J Neural Transm. 116, 351-355 (2009).</li>
<li>Koito, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+brain+aggregate+cultures+for+neuron+and+glia+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat brain aggregate cultures for neuron and glia development studies.</a> J Vis Exp. 31, (2009).</li>
<li>Brewer, G. J., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+growth+of+hippocampal+neurons+in+defined+medium+at+low+density%3A+advantages+of+a+sandwich+culture+technique+or+low+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density: advantages of a sandwich culture technique or low oxygen.</a> Brain Res. 494, 65-74 (1989).</li>
<li>Lelong, I. H., Petegnief, V., Rebel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cells+mature+faster+on+polyethyleneimine+coated+plates+than+on+polylysine+coated+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuronal cells mature faster on polyethyleneimine coated plates than on polylysine coated plates.</a> J Neurosci Res. 32, 562-568 (1992).</li>
<li>Potter, S. M., Pine, J., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+transplant+staining+with+DiI+and+vital+imaging+by+2-photon+laser-scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Microsc+Suppl%22%5BJournal%5D)">Neural transplant staining with DiI and vital imaging by 2-photon laser-scanning microscopy.</a> Scanning Microsc Suppl. 10, 189-199 (1996).</li>
<li>Rolston, J. D., Gross, R. E., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low-cost+multielectrode+system+for+data+acquisition+enabling+real-time+closed-loop+processing+with+rapid+recovery+from+stimulation+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">A low-cost multielectrode system for data acquisition enabling real-time closed-loop processing with rapid recovery from stimulation artifacts.</a> Front Neuroengineering. 2, (2009).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+all-channel+stimulator+for+electrode+arrays%2C+with+real-time+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">A versatile all-channel stimulator for electrode arrays, with real-time control.</a> J Neural Eng. 1, 39-45 (2004).</li>
<li>van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+characterization+of+firing+dynamics+of+spontaneous+bursts+in+cultured+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 2051-2062 (2004).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extremely+rich+repertoire+of+bursting+patterns+during+the+development+of+cortical+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures.</a> BMC Neurosci. 7, (2006).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+multi-channel+stimulus+artifact+suppression+by+local+curve+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time multi-channel stimulus artifact suppression by local curve fitting.</a> J Neurosci Methods. 120, 113-120 (2002).</li>
<li>Bakkum, D. J., Chao, Z. C., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+activity-dependent+plasticity+of+action+potential+propagation+delay+and+amplitude+in+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-term activity-dependent plasticity of action potential propagation delay and amplitude in cortical networks.</a> PLoS One. 3 (5), e2088-e2088 (2008).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Jimbo, Y., Tateno, T., Robinson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+induction+of+pathway-specific+potentiation+and+depression+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous induction of pathway-specific potentiation and depression in networks of cortical neurons.</a> Biophys J. 76 (2), 670-678 (1999).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+nerve+cells%22">Culturing nerve cells</a>. , 2nd ed, MIT Press. Cambridge, Mass. (1998).</li>
</ol>

CMH는 공개 아무것도 없습니다.<br /&gt; JDR와 SMP는 Axion Biosystems에 대한 컨설턴트를 지급됩니다.<br /이 문서와 동영상&gt; 제출 요금 및 비디오 처리 수수료는 우아하게 멀티 채널 시스템에 의해 후원되었다.

이 프로토콜은 방법을 문화에 대한 지침을 보여 주며의 연결을 미세 전극 배열에 네트워크뿐만 아니라에서 녹화 및 네트워크의 연결을 자극에 대한 소개를 유지합니다. MEAs에서 녹화 더 일반적인 문제 중 일부는 또한 MEA 문제 해결 섹션에서 논의되었습니다. 전반에 걸쳐 논의하고 자주 이러한 변화는 특정 실험 설계에서 요구하는 특정 조건을 최적화하기 위해 활용하는 범위 내에서 프로토콜 가끔 차이가 있습니다. 여기에 제시된 기록하고 자극 시스템 MCS의 preamp와 NeuroRighter 15 설계된 우리의 사용자 정의 구성이지만,의 연결 네트워크 인터페이스를 제공할 수있는 여러 다른 시스템이있다. 특정 설정을 선택하면 특정 실험 요구 사항에 따라 달라집니다. 간단한 녹음 및 자극의 예제 MEAs에 그러나 이러한 문화는 시냅스의 연결 활동과 네트워크 연결에 관한 복잡한 질문에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수있는이 프로토콜에서 제공되었습니다. 위에서 언급한 바와 같이 지속적인 작업이 세포 소성과 같은 프로세스를 연구하기 위해이 기술을 활용이며, 개발, excitotoxicity 및 neurodegeneration. 6-10 예를 들어, 우리의 실험실에서 최근 간행물 재현성 목표가 실시간 폐루프 자극과 함께 체외로 배우는 감독했다 현재의 연결을 네트워크 활동 3 응답. MEA의 문화가 자주 몹시 신경을 쓰는하고 섬세한 있지만, 그들의 단순 성과 접근성 (그대로 동​​물에 비해) 덕분에, 그들은 네트워크 수준의 연결 활동을 공부위한 강력한 모델을 제공합니다.

용품 <ul><li> 일회용 용기 상단 필터 (150ml, 0.2μm 기공 크기, Nalgene # 565-0020) </li><li> 배아 일 18 시간 초과 - 임신 여성의 쥐 </li><li> Microelectrode 배열 (B1, 프로토콜의 설명 참조) </li><li> Microelectrode 어레이 뚜껑 (프로토콜, B3의 설명 참조) </li><li> 나일론 셀 스트레이너 (40μm, BD 팔콘, # 352340) </li><li> 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 (살균, 15ml) </li><li> 폴리스티렌 페트리 요리 (살균 35mm 및 100x15mm) </li><li> Pipet 팁 (살균, 20μl, 200μl와 1000μl) </li><li> Serological pipets (5ml) </li></ul> 장비 : <ul><li> 생물 안전 캐비닛 / 층류 흐름 후드 </li><li> 셀 카운터 </li><li> 원심 분리기 </li><li> 얼음 컨테이너 </li><li> 해부 가위와 집게 (소독) </li><li> 층류 후드에 현미경을 해부 </li><li> 휴대용 전기 pipetman </li><li> Hemacytometer </li><li> Isofluorane 및 가스 챔버 </li><li> 라이트 현미경 </li><li> 휴대용 pipetman (P - 20 (20μl), P - 200 (200μl), P - 1000 (1000μl)) </li><li> MEA 기록 시스템 (프로토콜, D1의 설명 참조) </li><li> 쥐 기요틴 </li><li> 트라이 - 가스 배양기 (프로토콜, B15에 대한 설명을 참조) </li><li> 후드에 부착된 흡인기로 진공 플라스크 </li><li> 와동 </li><li> 워터 목욕 (35-37 ° C) </li></ul> 솔루션 및 시약 : BSA 솔루션 : 확인 5% BSA 인산염의 (시그마 A - 9418)은 생리 산도 7.4와 0.2μm의 필터를 버퍼. 이 솔루션은 4 ° C 몇 달 동안 미리 준비하고 저장할 수 있습니다. 셀 매체 : 90 ML Dulbecco의 수정 이글 배지 (어바인 과학 9,024) 10 ML 말 혈청 (Gibco 16,050) 1ml 나트륨 pyruvate (Gibco 11360, 100mM), 250 μl GlutaMAX (Gibco 35,050) 및 인슐린 (최종 농도를 결합 2.5 μg / ML, 시그마 I - 5500)는 다음 0.2 μm의 filter.22 따뜻한 통과하고 사용하기 전에 인큐베이터에있는 세포 매체를 평형. papain 솔루션을 준비 해부 솔루션 : 23 <table border="1"><tr><td> 해부 솔루션 (100ml 주식) </td><td> 4, 순서 필터 0.22 μm의 및 상점을 결합 ° C. </td><td></td></tr><tr><td> 구성 요소 </td><td> 볼륨 ML </td><td> 최종 농도 (㎜) </td></tr><tr><td> 두 번 증류수 </td><td> 91.175 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> 0.58 </td><td> 5.8 MM </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 0.025 </td><td> 0.25 MM </td></tr><tr><td> 0.5 M의 HEPES </td><td> 0.32 </td><td> 1.6 MM </td></tr><tr><td> 0.5 % 페놀 레드 </td><td> 0.2 </td><td> (0.001 %) </td></tr><tr><td> 0.1 N NaOH </td><td> 0.2 </td><td> 0.2 MM </td></tr><tr><td> 2 M Na2SO4 </td><td> 4.5 </td><td> 90 MM </td></tr><tr><td> 1 M K2SO4 </td><td> 3.0 </td><td> 30 MM </td></tr><tr><td> 0.1 M Kynurenic 수 소산 </td><td> 1.0 </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> 5 MM APV </td><td> 1.0 </td><td> 0.05 MM </td></tr></table> 이 솔루션은 4 ° C 몇 달 동안 미리 준비하고 저장할 수 있습니다. DNAse I : Invitrogen (# 18047019). 50μl aliquots는 -80 ° C.에 냉동 플래시 저장됩니다 나누어지는는 세포 분리 과정을 시작하기 전에 층류 후드에서 해동합니다. 행크의 균형 소금 솔루션 : 시그마 (# 4891). 1X 솔루션은 무균 0.2μm의 필터와 4에 저장된 ° C.는, 탈이온수에 준비가되어 있습니다 최대 절전 모드 솔루션 : culturing의 날에 준비합니다. 2 ML B - 27 보충제 (50X, Invitrogen # 17504)와 0.2 μm의에서 필터 98 ML L - 15 중간 (Invitrogen 11,415)을 결합합니다. Laminin 솔루션 : culturing의 날에 준비합니다. 0.02mg/ml의 최종 농도에 대한 980 μl 셀 매체 laminin의 20μl를 (1mg/ml, 시그마 L - 2020) 희석. laminin (1mg/ml) 20 μl aliquots는 -80 ° C에 보관하고 사용 직전 해동됩니다. 해동하면 벤치 위에 발생할 아니라 물 목욕과 같이 급속한 때로는 laminin의 겔화으로 이어질 수 있습니다 해동. Papain 솔루션 : 23 30-32로 해부 솔루션의 따뜻한 10 ML (위) ° C. 200 개가에게 papain을 추가 (시그마 P - 4762) 및 1.6 MG L - 시스테인 (시그마 C - 7880). 0.1 N NaOH의 약 14 μl와 7.4으로 산도를 조정합니다. 솔루션 CL까지 약 30 분 동안 품어귀, 필터 0.2 μm의, -80 15 ML의 폴리 프로필렌 살균 원뿔 튜브 및 저장 2 ML aliquots의 액체 질소로 동결 플래시 ° C. ° C 이전의 프로토콜을 시작하는 35-37에서 나누어지는를 녹여. Polyethyleneimine (PEI) 솔루션 : 13 PEI 100 μl (50 % W / V, 시그마 P - 3143)는 0.05 %의 최종 농도 W / V. 100 ML 나트륨 borate 버퍼 (0.1 M 산도 8.4, 시그마 B - 9876)에 희석입니다 0.2 μm의에서 멸균 필터. 이것은 사전에 준비하고 몇 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 무균 드 이온화된 물 : 압력솥 사용하기 전에 실온에 시원한 수 있습니다. 트립신 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), Gibco 25,200로 0.25 %) 1ml aliquots는 -80 ° C.에 냉동 플래시 저장됩니다 Aliquots는 사용하기 전에 35-37 ° C의 물을 욕조에서 해동합니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (meas)에

How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs)

지난 세기, 전세계 많은 neuroscientists이의 연결을 네트워크가 작동 방법을 이해하기 위해 자신의 인생을 헌신하고 왜 그들은 각종 질병에서 일하고 중지합니다. 연구 neuropathological 관찰, 유전자 라벨과 형광 현미경, 그리고 dissociated 뉴런과 슬라이스 준비 모두에서 세포 녹음을 포함합니다. 이 프로토콜은 마이크로 전극 배열 (또한 다중 전극 배열, MEAs)에 dissociated의 연결 문화를 성장과 관련된 또 다른 기술을 설명합니다. 다른 기술을 통해이 시스템을 사용하는 여러 장점이 있습니다. MEAs에 Dissociated의 연결을 문화 네트워크 활동이 배열 다중 전극을 통해 전기 자극을 시퀀스로 조절할 수있는 단순화된 모델을 제공합니다. 네트워크가 작은이기 때문에, 자극의 영향은 그대로 준비에 그런 경우가 아니라 관찰 지역으로 제한됩니다. 세포는 다양한 영상 기술을 모니터링하는 형태로 쉽게 변화를 만드는 monolayer 성장. 마지막으로, MEAs의 문화는 다른 culturing 기술과 본질적으로 어떤 명확한 시간 한계를 제거 체외에서 일년 이상 살아남을 수 있습니다. 1 전세계 우리의 실험실과 다른 사람의 연결 네트워크에 대한 중요한 질문을이 기술을 활용하고 있습니다. 이 프로토콜의 목적은, 돌보는, 설정에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공하는 것입니다. 네트워크에서 생리학 관련 질문을과 더 나은 이해를 선도하는 세포 수준의 수단을 제공 체외 네트워크에서 두뇌 기능과 장애.

이 프로토콜은 설정을 돌보는에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공합니다.<em&gt; 체외에서</em&gt; 네트워크 네트워크 및 두뇌 기능과 기능 장애의 더 나은 이해를 선도하는 세포 수준에서 생리학 관련 질문을위한 수단을 제공합니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

For the last century, many neuroscientists around the world have dedicated their lives to understanding how neuronal networks work and why they stop ...

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로 전극 어레이에서 신경 세포망을 배양, 기록 및 자극하는 것입니다. 이는 먼저 배양을 위한 시약과 마이크로 전극 어레이를 준비함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 18일 쥐 배아에서 피질 뉴런을 해리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 미세 전극 어레이에 뉴런을 플레이트하고 2-3주 동안 배양하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 미세 전극 어레이에서 자극 및 기록을 통해 신경 네트워크를 실험하는 것입니다. 궁극적으로, 미세 전극 어레이에서 세심한 세포 배양을 통해 기록 및 자극 소프트웨어를 사용하여 신경 네트워크에서 자발적이고 자극적으로 유발된 활동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 스티브 포터 교수입니다. 저는 조지아 공대 의생명공학과 문화학과의 신경공학 연구소 소장입니다. 이 부서는 Emory University School of Medicine과 공유합니다.저는 포터 박사 연구실의 박사후 연구원인 채드 헤일즈입니다. 저는 또한 에모리 대학교 의과대학 신경학과의 인지 행동 펠로우입니다. 오늘 우리는 다중 전극 어레이에서 뉴런을 배양하고 관리하는 방법을 보여줄 것입니다.이렇게. 우리는 이를 사용하여 체외 학습 및 기억 및 네트워크 정보 처리를 연구합니다. 이제 시작하겠습니다: 층류 후드에서 전극 손상을 방지하기 위해 100mm 페트리 접시에 있는 깨끗하고 멸균된 MEA의 중앙에 다중 채널 시스템 마이크로 전극 어레이 또는 MEA 피펫 100마이크로리터의 폴리에틸렌 아민을 준비하기 시작합니다.MEA 표면에 단단한 물체를 만지지 마십시오. 가스 투과성 테프론 멤브레인이 장착된 멸균 뚜껑으로 접시를 가볍게 덮고 후드에서 30분 동안 배양합니다. 테프론 멤브레인 뚜껑은 증발을 최소화하면서 기체 교환을 가능하게 하고 습도가 낮은 환경에서 배양할 수 있습니다.습도가 낮기 때문에 인큐베이터에서 섬세한 전자 장치를 사용할 수 있으며 오염률을 줄일 수 있습니다. 흡인하여 PEI를 1-2밀리리터의 멸균 탈이온수로 MEA를 세 번 헹굽니다. 후드의 뚜껑을 열고 최소 30분 동안 또는 완전히 마를 때까지 말리십시오.이 프로토콜의 텍스트 부분에 설명된 대로 E 18 피질 뉴런 해리를 완료합니다. 긴장 후 세포를 변형시킵니다. 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 배지를 사용하여 세포 현탁액을 4ml로 조심스럽게 가져옵니다.500마이크로리터의 5%BSA 용액을 200Gs의 속도로 6분 동안 세포 현탁 원심분리기 아래에 층을 이룹니다. 세포가 회전하는 동안 MEA가 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 20 마이크로 리터의 라미네이트 용액을 MEA 중앙에 조심스럽게 피펫으로 넣습니다.기포가 유입되지 않도록 하고 모든 전극이 덮여 있는지 확인하십시오. 라미닌의 증발을 방지하기 위해 테프론 뚜껑을 MEA에 부드럽게 놓습니다. MEA는 뚜껑을 놓을 때 완전히 평평한 표면에 있어야 합니다.그렇지 않으면 압력으로 인해 어레이의 유리 바닥에 균열이 생길 수 있습니다. 섭씨 35-37도, 이산화탄소 5%, 산소 9%, 습도 65%에서 20분 동안 접시를 배양합니다. 이제 회전된 세포를 후드로 옮깁니다.세포 펠릿은 튜브 바닥에 보여야 합니다. 불완전한 펠릿의 경우 상등액을 제거하고 예약하십시오. 펠릿을 부드럽게 다시 현탁시킵니다.혈구 분석기에서 현탁액의 10마이크로리터에 있는 세포 수를 계산하고 현탁액을 원하는 농도로 희석합니다. 일반적으로 세포 배지가 있는 마이크로리터당 1000-3000개의 세포. 어레이의 라미네이트 배양이 완료되면 즉시 액적을 흡인하십시오.15-20 마이크로 리터의 세포 현탁액을 MEA의 라미네이트 코팅 된 영역에 피펫팅합니다. 접시를 테프론 뚜껑으로 덮고 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 위상차 현미경으로 접시를 검사하여 세포가 부착되어 모든 전극을 덮고 있는지 확인합니다.적용 범위가 불완전한 경우 더 많은 세포를 추가하고 다시 배양하십시오. 접시에 1ml의 따뜻한 평형 세포 배지를 천천히 주입합니다. 테프론 뚜껑을 닫고 접시를 24시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.다음 날. 위상차 현미경에서 배양된 세포가 부착되어 있는지, 적절한 관리와 먹이를 주면 파편과 세포 사멸의 양이 제한되는지 확인합니다. 이 기사에 실린 본문에서 설명했듯이, 이런 방식으로 배양된 뉴런은 1년 이상 생존할 수 있다.2-3 주 후, 문화는 활동의 꾸준한 상태에 도달하고 이 비디오에서 기록 할 수 있습니다 이제 맞춤형 신경 작가 프로그램으로 기록하는 것을 보여줍니다. 접시를 다시 섭씨 35-37도, 이산화탄소 5%, 산소 9%, 습도 65%로 유지되는 기록 인큐베이터로 옮깁니다. 이상적인 온도와 pH를 유지하려면 접시를 이동할 때 지면과 평행하게 운반하고 기질에서 세포를 제거할 수 있는 빠른 움직임을 피하십시오.접시에서 MEA를 들어 올려 다중 채널 시스템에 놓습니다. 녹화 preem ampliifier, 내부 접지를 Preem ampliifier 접지. 프리 앰프는 여기에 첨부된 텍스트에 설명된 대로 열을 발산하는 기능을 하는 펠트 장치에 있으며, 프리 앰프는 인큐베이터 밖으로 이동되었습니다.접시의 적절한 좌석을 보여주는 것이 좋습니다. 70% 에탄올을 적신 물티슈를 사용하여 어레이 주변의 접점을 청소합니다. MEA가 제대로 장착되었는지 확인하고 덮개를 아래로 잠그십시오.필요한 경우 면봉을 사용하여 어레이의 접점을 정렬합니다. neuro writer에서 실험에 적합한 설정을 선택합니다. 레코드 스위치를 위로 올려야 합니다.데이터를 파일에 쓰려면 시작 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 이제 스파이크 화면에는 실행 중인 활동 흔적과 배경 소음이 표시되며, 가끔 활동 전위와 활동이 급증합니다. 전극에 너무 많은 노이즈가 표시되면 사전 ampliifier 덮개, 작은 쓰레기 조각, 매체 방울, 열화된 전극 표면 또는 덮개를 가로지르는 투명한 멤브레인이 접촉을 방해하는 li-ifier liifier 뚜껑에 잘못 정렬되어 있을 수 있습니다.접촉 핀을 확인하고 필요한 경우 70% 에탄올에 적신 면봉으로 조정합니다. 스파이크 파형 탭을 클릭하여 화면 보기를 스파이크 감지 모드로 변경하며, 여기서 활동 전위는 정적 3밀리초 길이의 창에 표시됩니다. MEA의 뉴런 네트워크를 자극하려면 기록 설정 탭에서 salpa 알고리즘을 훈련하여 자극 아티팩트를 제한하고 온라인 설정 탭에서 salpa를 활성화합니다.기록이 시작되면 STEM 탭을 클릭하여 개방 루프 프로그램을 사용하여 하나의 전극을 자극하고 접시의 반응을 관찰할 수 있는 적절한 자극 패러다임을 설정합니다. 개방 루프 섹션에서 적절한 설정을 선택한 다음 시작을 누릅니다. 기본 스파이크 탭과 스파이크 파형 탭에서 응답을 시각화합니다.이 영화는 체외에서 7개의 뉴런과 신경교세포가 성장하면서 MEA에서 연결된 네트워크를 형성하면서 미세 전극이 보이는 것을 보여줍니다. 이것은 뉴런 네트워크에서 2분 동안의 자발적인 활동에 대한 래스터 플롯입니다. 각 검은색 점은 활동 전위를 나타냅니다.두 번의 활동 폭발이 파란색 화살표로 표시됩니다. 여러 전극에 대한 응답은 네트워크 연결의 함수입니다. 다음은 16초의 자극 유발 활동에 대한 래스터 플롯입니다.빨간 별은 자극을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 여러 전극에 걸쳐 시냅스 활동의 폭발을 성공적으로 유도한 5개의 자극을 보여줍니다. 때때로 자극은 폭발을 일으키지 않습니다.여기 파란색 화살표에서 우리는 마이크로 전극 어레이에서 뉴런 네트워크에서 기록을 배양하고 자극하는 방법을 보여주었습니다. 아마도 가장 중요한 걱정은 배양균이 감염되는 것을 방지하고 증발을 줄이는 것입니다. 이와 같은 반투과성 멤브레인이 있는 뚜껑을 사용하면 밀봉되어 증발 및 감염을 방지하며 몇 달, 어쩌면 일 년 이상 배양할 수 있습니다.그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

대뇌 피질의 임계 상태 역학 지표의 연결 눈사태, 즉 스케일 - 불변량 spatio - 관자놀이 활동 파열을 연구하는 강력한 방법입니다. 눈사태 정확하게 제어 조건 하에서 평면 통합 다중 전극 어레이 (MEA)와 활동의 장기 측정을 허용 교양 피질의 표면 레이어를 개발에 자발적으로 등장.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

이 비디오는 해마 뉴런이 있는 평면 미세 전극 어레이에 결합된 3D 뉴런 배양의 발달을 보여줍니다. 분리된 뉴런은 미세 전극 어레이의 활성 영역에서 2D 네트워크를 형성하고 멤브레인 인서트가 있는 다중 웰 플레이트의 유리 마이크로비드에 부착됩니다. 이러한 뉴런 코팅된 마이크로비즈를 전극으로 전달하면 상호 연결된 3D 신경망으로 구성됩니다.

micro-electrode arrays에 결합된 3차원 뉴런 네트워크 구축

이 비디오는 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 뉴런의 전기생리학적 활성을 기록하는 방법을 보여줍니다. 뉴런-성상세포 공동 배양을 포함하는 멀티웰 MEA의 전기생리학적 활성을 기록하여 네트워크 내 여러 뉴런의 활동 전위를 감지하여 hiPSC가 뉴런으로 성공적으로 분화되는 것을 확인합니다.

마이크로 전극 어레이를 사용한 뉴런 네트워크의 전기생리학적 활성 측정

이 비디오는 다전극 배열(MEA)에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런(SGN) 배양에서 자발적이고 자극에 의존하는 신경 활동을 기록하는 것을 보여줍니다. 여기에는 MEA를 세척 및 준비하고, 자발적인 신경 활동을 기록하고, 자극에 의존하는 신경 활동을 식별하기 위해 제어된 전기 자극을 적용하는 것이 포함됩니다.

다전극 배열을 사용한 1차 쥐 나선 신경절 뉴런의 신경 활동 분석

이 비디오는 다중 전극 어레이 또는 MEA 장치를 사용하여 캡처한 척수 절편의 유기형 공동 배양에서 얻은 전기생리학적 기록을 보여줍니다. 이러한 기록은 절편 사이의 신경 세포 재생을 평가합니다. 관찰된 동기화된 전기 활동은 성공적인 신경 재생을 확인합니다.

전기생리학적 기록(Electrophysiological Recordings for Assessing Neuronal Regenerations in Co-cultured Spinal Cord Slices)

이 비디오는 MEA(Multielectrode Array)를 사용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리를 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 3D 구 내에서 신경망 역학 및 시냅스 네트워크 버스트 활동을 이해할 수 있습니다.

Multielectrode Arrays를 활용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리학을 측정합니다.

이 비디오는 뉴런 네트워크 활동을 기록하기 위한 뉴런-성상세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. MEA(Multi-electrode Array) 플레이트에서 운동 뉴런과 성상세포의 공동 배양을 확립한 후, MEA를 사용하여 뉴런 네트워크의 동기 리듬 전기 활동을 세포 외로 기록했습니다.

Neuron-Astrocyte 공동 배양에서 Neuronal Network의 전기생리학적 활동 기록

이 연구에서는 3D 뉴런 배양이 평면 MEA(Micro-Electrode Arrays)에 결합되는 새로운 실험 모델을 presented. 3D 뉴런이 유리 마이크로비즈로 구성된 골격에 뉴런을 파종하여 네트워크를 구축하고, 그 위에서 뉴런이 자라나 상호 연결된 3D 구조를 형성합니다.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

우리는 뉴런 반응 프로파일을 연구하고 자극 매개변수를 최적화하기 위해 다중 전극 어레이에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런 외식재를 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 연구는 인공와우의 뉴런-전극 인터페이스를 개선하여 환자의 청력과 장치의 에너지 소비에 도움이 되는 것을 목표로 합니다.

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

다중 전극 어레이에서 배양 된 마우스 신경 세포는 전기적 자극 후 반응의 증가를 나타낸다. 이 프로토콜은 뉴런을 배양하는 방법, 활동을 기록하는 방법, 자극 패턴에 반응하도록 네트워크를 훈련시키는 프로토콜을 수립하는 방법을 보여줍니다.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

배우세요 미세전극배열(MEA)에서 신경망을 배양하고 기록 및 자극하는 방법을. 태아 18일 랫뇌 피질신경원을 분리하여 2~3주간 배양하면 자발적 및 자극유발 활동을 관찰할 수 있습니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

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