Name: IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 배우세요 면역침전과 유동세포계측법을 결합한 IP-FCM 기법으로 단백질 상호작용을 분석하는 방법을. 소량 샘플로도 높은 신호대잡음비를 얻어 유전자 변형 없이도 생화학적 과정을 연구할 수 있습니다.

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원시 단백질 - 단백질 상호 작용 및 유동세포계측법에 의해 multiprotein의 단지의 높은 감도 감지 및 정량 분석 : **이 비디오 프로토콜은 관련 출판 일을 기반으로합니다. 아담 G. Schrum, 다이애나 길, 일레인 P. Dopfer, 데이비드 L. 위스트, 로렌스 A. Turka, 볼프강 WA Schamel, 에드 파머. 과학의 STKE 2007 (389) : pl2 6 월 5, 2007, [간접 : 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">본 자료를 보시려면 여기를 클릭하십시오</a> . 시작하기 전에 다음 수성 주식 솔루션 준비 : <table><tbody><tr><td> MES 커플링 버퍼 : </td><td> 25 스토어 ° C </td></tr><tr><td> MES, 산도 6.0 </td><td> 50 MM </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 1 ㎜ </td></tr><tr><td> 칭 / / 스토리지 (QBS) 버퍼를 차단 : </td><td> 4 스토어 ° C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 0.02 % </td></tr><tr><td> PBS, 산도 7.4 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FCM 버퍼 : </td><td> 4 스토어 ° C </td></tr><tr><td> 트리스, 산도 7.4 </td><td> 50 MM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 100 MM </td></tr><tr><td> 나트륨 azide </td><td> 0.02 % </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5% </td></tr><tr><td> PBS, 산도 7.4 </td><td> 1X </td></tr></tbody></table> 사용하기 전에 바로 준비 : <table><tbody><tr><td> EDAC - MES : </td><td> MES 커플링 버퍼 50 MG / ML의 EDAC 분말을 디졸브 </td></tr><tr><td> Digitonin 솔루션 (2 % W / V) : </td><td> 95 가열하여 DH 2 O에서 digitonin 가루를 해산 ° C 5 분에 대한 다음 얼음에 냉각 </td></tr><tr><td> 용해 완충액 : </td><td></td></tr><tr><td> 트리스, 산도 7.4 </td><td> 50 MM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 150 음 </td></tr><tr><td> Digitonin 솔루션 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 프로 테아제 억제제 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 얼음 계속 </td><td></td></tr></tbody></table> 1. 비즈로 mAb의 커플링 <ol><li> PBS에 diluting와 hemacytometer로 계산하여 구입한 주식의 구슬의 농도를 결정합니다. 계산을위한 구슬의 1:10000 희석과 함께 시작합니다. </li><li> 피펫 18 1.5 - ML의 microcentrifuge 관으로 X 10 6 구슬. </li><li> 각 세척 후 25 3 분 2만그램 ° C에서 centrifuging, 0.5-1.0 ML MES 커플링 버퍼에있는 비즈에게 2-3 번 씻으십시오. </li><li> 50 μL MES 커플링 버퍼에있는 구슬을 Resuspend. </li><li> 신선한 EDAC - MES 20 μL를 추가하여 비즈의 카르 복실 그룹을 활성화합니다. </li><li> 25 ° C 수동으로 최대 pipetting 아래로 약 15 분 가볍게 섞는다. </li><li> 25 3 분 20,000그램에 centrifuging ° C를 각 씻고 나서, 0.5-1.0 ML PBS의 활성화 비즈에게 2-3 번 씻으십시오. </li><li> 50 μL PBS에서 활성 비즈를 Resuspend. </li><li> 활성 비드 솔루션 IP mAb (0.2-1.0 MG / ML 재고 농도에서) 50 μL를 추가합니다. </li><li> 진동 흔드는에 튜브를 삽입하여 25 ° C에서 3-4시간위한 섞는다. 튜브의 바닥에있는 구슬을 정착 방지하기 위해 충분히 흔들어. </li><li> 와시 mAb - 결합 구슬은 0.5-1.0 ML PBS 2 3 회, 각 씻어 후 25 3 분 2만그램에서 ° C centrifuging. </li><li> 100 μL QBS 버퍼에있는 구슬을 Resuspend. 이러한 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> 구슬을 중단하는 것은 물론, PBS에서 1:200-1:10,000을 희석하고 hemacytometer로 계산됩니다. 농도는 각 IP 또는 풀다운 실험에 사용되는 구슬의 개수를 정확하게 제어할 수 있도록, 각 예비 배치에 대한 측정해야합니다. </li></ol> 2. 포스트 핵 Lysate 준비와 IP 용해 방법 및 최적 용해 조건의 셀 유형과 검사되는 단백질 단백질 상호 작용에 따라 달라집니다. 프로토콜 번호가 존재하고 응용 프로그램을 수정할 수 있습니다. <ol><li> 이러한 lymphocytes, 또는 5 20 X 10 6 '작은'세포를 Lyse X 10 등 macrophages 또는 종양 세포와 같은 6 '대형'세포, 얼음에 20 분에 대해 1.5 ML microcentrifuge 관 100 μL 신선한 용해 버퍼 인치 필요에 따라 용해 볼륨을 스케일. </li><li> 핵 및 불용성 세포 파편을 제거하려면, 4 10 분 ° C.에 대한 2만g에서 lysate를 원심 분리기 뜨는 유지하고 펠렛을 삭제. </li><li> 섞어 부드럽게 pipetting 0.5 X 10 명확히 lysate로 5-2.5 X 10 5 mAb 결합 구슬을 추가합니다. 우리가 사용하는 최소 볼륨단일 IP를 수행 5 μL입니다. </li><li> 추운 방에서 하룻밤에 수직 회전 바퀴 4시간에 놓습니다. 정착의 구슬을 방지하기 위해 충분한 속도로 설정하십시오. 그것은 회전하는 동안 튜브의 바닥에 남아 낮은 볼륨의 IP를 액체에 대한 허용됩니다. </li></ol> 3. Fluorochrome - 복합 항체와 비드 - 캡처 단백질의 탐색 <ol><li> 4 2만그램에서 centrifuging ° C를 각 씻어 후 3 분, 0.2-1.0 ML 얼음처럼 차가운 FCM 버퍼의 IP 비즈 두 번 씻으십시오. </li><li> 굴뚝 - 바닥 접시 5 개 이상의 1.5 ML microcentrifuge 튜브 또는 우물의 각에 100 μL FCM 버퍼와 나누어지는 20 μL의 구슬을 Resuspend. </li><li> 샘플로 fluorochrome - 복합 mAbs를 추가합니다. FCM은 공급 업체의 지시에 따라 또는 경험적으로 결정 농도에 따라 얼룩 수행합니다. 출발점으로, 튜브 당 또는 잘 주식 항체 솔루션의 0.2-1 μL를 (0.2-1.0 MG / ML에서) 추가하고 얼음에서 40 분 품어. </li><li> 세차 4 2만그램에서 centrifuging, 1.0 ML 얼음처럼 차가운 FCM 버퍼의 1.5 ML 튜브에 두 번 구슬을 탐색할 · 각 세척 후 3 분 C. 부드럽게 구슬을 방해하지 않도록 돌봐 각 세척 후 표면에 뜨는를 제거합니다. 굴뚝 - 바닥 접시, 4에서 5 분 1,000그램에 centrifuging, 0.2 ML 얼음처럼 차가운 FCM 버퍼로 두 번 씻어 ° C를 각각 씻고 나서. 멀티채널 pipettor이 단계에 유용합니다. 굴뚝 - 바닥 플레이트의 비즈에서 뜨는 제거하려면, '영화'는 접시 한 ​​다음, 계속 거꾸로 반면, 우물의 가장자리로부터 drips을 얼룩. 각 우물에 잔류 볼륨은 구슬을 포함, 약 20 μL 것입니다. </li><li> 샘플 당 200 μL FCM 버퍼에있는 구슬을 Resuspend. 표시 외과 튜브로 전송. 샘플 지금 FCM에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 4. FCM 취득 이 프로토콜에 설명되어있는 CML 비즈는 직경 3-5 μm의, 정지 마우스 림프구의 약 절반 직경입니다. 따라서 수동으로 규모 등록 비드 이벤트의 인구에 대한 순서로 전달 스캐터 (FSC) A 이득과 사이드 스캐터 (SSC) 전압을 증가시킬 필요가있을 수도 있습니다. 개인 IP 구슬은 단일 단단히 클러스터된 인구를 형성한다. 설정 및 문은 구슬 doublets와 찌꺼기를 제외 조정해야합니다. <ol><li> 이전 실행 구슬 또는 구슬 기준을 일부 cytometers에 샘플 입구 주변 비말 억제 슬리브를 제거합니다. 이 입구의 선택을 취소 한 샘플에서 다른 이월되는 구슬을 방지하므로, 칼집 유체는 샘플 사이에 똑 수 있습니다. </li><li> 부정과 긍정적인 형광 극단 모두 로그 스케일 X - 축에 동시에 나타나도록 설정을 조정 레이블이 지정되지 않은 구슬, 형광의 부정적인 제어 및 레인보우 보정 입자 (RCPs), 형광의 긍정적인 컨트롤을 사용합니다. 이것은 실험 샘플의 형광도 규모에 될 수 있도록합니다. 그래서 FSC와 SSC 매개 변수뿐만 아니라, 게이트 위치가 일시적으로 해당 샘플에 대한 변경해야 할 수도, RCPs은 CML 비즈보다 작은됩니다. </li><li> RCPs과 교정이 완료되면 레이블이 지정되지 않은 - 구슬 설정으로 돌아갑니다. 샘플마다 하나의 형광 프로브를 사용하는 경우에는 형광 보정이 필요하지 않습니다. 일반적으로, 우리는 FCM 샘플마다 하나의 fluorochrome - 복합 mAb와 multiprotein의 단지를 탐사하고, 우리는 다양한 subunits 특정 mAbs과 병행하여 비드 샘플을 얼룩하여 여러 상호 작용 파트너를 확인합니다. </li><li> 형광 데이터 파일을 수집하고 저장합니다. 분석은 다음 유동세포계측법와 같은 CellQuest, FlowJo으로 소프트웨어 또는 CFlow를 사용하여 수행할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 마우스 변형에서 TCR/CD3 multiprotein 복합을위한 IP - FCM. T 세포는 BALB / C는 1 % digitonin에 lysed 있었고, lysate는 안티 - CD3ε 비즈를 사용하여 IP - FCM를 받게되었다. 캡쳐 단지는 TCR - β의 상당 수량 (보라색 지역)을 포함하고 공동 관련된 인 경우에는 3 번 CD - ε (녹색)하지만, 가까운 같은 Thy1.2 같은 다른 단백질의 배경 수준 (없는 면역 글로불린 프로브, 핑크 추적에 의해 정의)에, CD45, 또는 H - 2K (D) (갈색, 오렌지, 파랑 흔적, 각각). 비슷한 방식으로 이전에 게시된 결과 1-6을 참조하십시오.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 정보는 신호 전달, 가계의 성숙, 세포주기 진행 및 apoptosis의 폭포 많은 세포 프로세스의 분석 관련성이있다. IP - FCM은 단백질의 상호 작용을 검토하고 원시 형태의 multiprotein의 단지의 멤버를 정의하기 위해, 빠른 양적 및 민감한 방법을 제공합니다. 비즈는 결합 및 세포 lysates incubated로 하루에와 탐지하고 그 다음날 분석할 수 있습니다. 96 - 웰 플레이트 형식은 통계 또는 검사 목적을 위해 효율적인 데이터 수집을 제공하기 위해 한 번에 분석하기 위해 샘플을 다수의 허용합니다. 형광 비드 표준을 사용하여 각 비드 점령 단백질의 수를 추정 수 있습니다. 거의 원본 자료는 캡처 및 탐지에 필요한이므로 제한된 샘플 및 부족 analytes은 여전히​​ 여러 상호 작용에 대한 분석을하실 수 있습니다. IP - FCM이 아닌 생리적 환경에서 단백질의 혼합 유전 공학, 에피토프 - 태그, 변성, 또는 - 체외 필요하지 않지만, 그것은 그것에 적용과 가치 및 접근 도구를 만들고, 이들과 다른 기술을 결합 수 있습니다 많은 생물 학적 시스템. 문제 해결 : 대부분의 IP - FCM 실험에 유용 단백질 상호 작용 데이터에게 그들이 시도하는 처음 생성합니다. 그러나, IP - FCM의 최적화 구슬, 단백질 복잡한 캡처 및 바인딩 형광 프로브에 항체 활용을 향상시킬 수 있습니다. IP 항체 활용의 효율을 방지 면역 글로불린 항체와 직접 결합 구슬을 탐색하여 결정하실 수 있습니다. 이 효율이 낮은 경우, 커플링 반응 중에 항체의 농도를 증가하는 것은 많은 IP 항체가 각각의 구슬에 첨부할 수 있습니다. 이것은 analytes의 향상된 캡처 및 검색의 결과로, IP 비드 배치의 바인딩 용량을 늘릴 수 있습니다. 이러한 낮은 mAb 커플링의 비드 부착 및 결과에 대한 mAb와 경쟁할 수와 같은 다른 기본 - 아민 포함하는 분자 (예 : 트리스, 소 혈청 알부민), 커플링 반응 동안에 존재해서는 안됩니다. 구슬로 mAb의 활용이 다른 이유로 문제가 증명하는 경우, 구슬 대신 아비딘 / streptavidin을 결합 수 있으며, biotinylated 항체는 이후 비 covalently 바운드 및 immunprecipitation 사용할 수 있습니다. 좋은 항체 활용에도 불구하고, 비드 - 관련 형광의 초기 감지는 낮은 수 있습니다. 첫째, 복잡한 촬영 자체가 적을 수 있습니다. IP - FCM은 단위 용해 량 당 lysed 세포의 수를 증가 analytes의 농도에 의존하기 때문에 analyte 캡처 및 감지를 높일 수 있습니다. 또한 캡처는 캡처 이하의 구슬에 걸쳐 단지, 그리고 탐지 비드 당 평균 형광 증가의 결과를 배포 lysate와 함께 incubated IP 구슬의 개수를 줄임으로써 향상된 수 있습니다. 둘째, 그것은 캡처한 단지에 프로브 항체의 액세스가 sterically immunoprecipitating 항체에 의해 방해되어 있습니다. 이 경우에는 문제가 및 / 또는 탐침을 캡처하는 다른 항체를 사용하여 해결할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>카르복실레이트 변형 폴리스티렌 라텍스(CML) 비드 (5mm 계면활성제 미포함)</td><td>시약</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>4&amp;#x00B0;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>레인보우 캘리브레이션 입자</td><td>시약</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>4&amp;#x00B0;C에서 보관하십시오.</td></tr><tr><td>2-[N-Morpholino] 에탄설폰산 (MES)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) 카르보디이미드 HCl (EDAC)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>-20&amp;#x00B0;C에서 건조 조건으로 보관하십시오.</td></tr><tr><td>AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64 및 Leupeptin을 포함하는 일반 용도 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O에서 100x 스톡 용액을 조제하십시오. 소분하여 -20&amp;#x00B0;C에서 보관하십시오. 장갑을 착용하고 취급하십시오.</td></tr><tr><td>PCR 플레이트, 96-웰 0.2mL, 투명, tall chimney</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>FCM 염색 중 마이크로원심분리 튜브 대신 사용</td></tr></tbody></table>

ip - fcm : 유동세포계측법에 의해 감지 immunoprecipitation

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

유동세포계측법 (IP - FCM)에 의해 감지 Immunoprecipitation은 단백질 - 단백질 상호 작용을 감지하고 quantifying위한 효율적인 방법입니다. 기본 원리는 촬영한 기본 analyte가 실제로 multiprotein의 단지 내에 관련된 다른 분자와 함께 감지할 수했었습니다 샌드위치 엘리사의 그것을 확장합니다. 절차는 관심의 단백질에 대한 단클론 항체 (mAb) 특정을 immunoprecipitating 세포 lysates 이러한 구슬을 잠복기, fluorochrome - 복합 프로브와 함께 캡처 단백질 단지를 프로빙 및 유동세포계측법의 구슬 - 관련 형광을 분석과 폴리스티렌 라텍스 microbeads의 공유 결합 결합을 포함한다. IP - FCM은 매우 민감한 것입니다 자신의 모국어 (비 변성) 상태에서 단백질의 분석이 가능하고, 중 반 정량 또는 정량 분석​​ 의무가 있습니다. 추가 장점으로 IP - FCM은 흐름 cytometer 이외의 유전 공학이나 전문 장비를 필요로하지 않으며 그것은 쉽게 높은 처리량 어플 리케이션에 적용할 수 있습니다.

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

유세포 분석법을 이용한 면역침전법(IP-FCM)은 단백질-단백질 상호작용을 검출하고 정량화하는 효율적인 방법입니다. 기본적인...

IP FCM 실험에서는 서로 상호작용하는 다양한 단백질을 식별하고 연구하기 위해 단백질 복합체를 비드에 포획합니다. 먼저, 표적 단백질에 특이적인 면역 침전 항체를 폴리스티렌 라텍스 비드에 공유 결합시킵니다. 두 번째 단계로, 이 비드들을 세포 용해물과 함께 배양하여 특정 단백질 및 상호작용 단백질이 비드에 결합하도록 합니다.포획된 단백질과 함께 비드(bead)를 수거한 후, 면역침전된 단백질과 연관되어 있을 수 있는 다양한 분자에 특이적인 형광 표지 항체로 세척 및 프로빙(probing)을 수행합니다. 마지막으로, 형광 표지된 비드를 유세포 분석기로 분석하여 어떤 단백질이 포획된 복합체에 존재하는지 또는 부재하는지 결정합니다. 면역침전 후 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 수행하는 것과 같은 다른 방법과 비교했을 때 이 기술의 장점은, IP-FCM이 유전자 공학적 조작이나 대용량의 샘플 크기를 요구하지 않고도 천연 단백질-단백질 상호작용을 평가할 수 있다는 점입니다.I-P-F-C-M은 적은 부피와 낮은 농도의 분석물로도 수행이 가능하여, 분석에 사용할 수 있는 생체 재료가 매우 적은 경우에도 높은 신호 대 잡음비를 얻을 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 위해 MES 결합 완충액, 퀀칭 블로킹 보관 완충액(QBS로 약칭) 및 유세포 분석(FCM) 완충액을 준비하십시오. 카르복실기 변성 폴리스티렌 라텍스 비드(CML 비드)를 PBS로 희석하고 혈구계수기로 측정하여 농도를 결정하십시오.비드의 농도가 결정되면, 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 18 × 10⁶ 개의 비드를 피펫으로 분주합니다. 실온에서 20,000 ×g로 3분 동안 원심분리하여 0.5~1 mL의 MES 커플링 버퍼로 비드를 2~3회 세척합니다. 각 세척 단계마다 비드를 원심분리하는 동안비드 활성화에 사용할 신선한 edac MES 완충액을 준비하십시오. 세척이 완료되면 완충액을 실온 또는 얼음 위에 보관하십시오. 마지막 세척 후, 비드를 50 µL의 MES 결합 완충액에 재현탁하십시오.그 후 비드 현탁액에 20 µL의 EEC MES를 첨가합니다. 비드의 카르복실기를 활성화하기 위해, 15분 동안 수동으로 피펫팅을 계속 반복하여 실온에서 부드럽게 혼합합니다. 이 단계는 많은 노동력이 소요되지만, 이러한 혼합 방식이 혼합 후 가장 좋은 결과를 제공합니다.활성화된 비드를 0.5~1 mL의 PBS에서 실온의 20,000 ×g로 3분 동안 원심분리하여 2~3회 세척합니다. 매 세척 단계 후, 최종 세척 후에는 활성화된 비드를 50 µL의 PBS에 재현탁하여 IP 항체를 비드에 결합시킵니다. 0.2~1 mg/mL 농도의 스톡에서 IP 단클론 항체 50 µL를 첨가합니다.항체 외에 일차 아민을 포함하는 분자가 존재하지 않는지 확인하십시오. tris 또는 bovine serum albumin과 같은 이러한 아민 함유 분자들은 비드 결합 과정에서 항체와 경쟁합니다. 진탕기(vibrating shaker)를 사용하여 비드-항체 현탁액을 실온에서 3~4시간 동안 혼합하십시오.비드가 튜브 바닥에 가라앉지 않도록 충분히 흔들어 줍니다. 결합 후, 항체 코팅 비드를 0.5에서 1 mL의 PBS로 20,000 ×g에서 원심분리하여 2~3회 세척합니다.매 세척 단계 후 실온에서 3분 동안 중력 침전시킵니다. 마지막으로 비즈를 100 µL의 QBS buffer에 다시 현탁합니다. CML 비즈에 단클론 항체가 결합되었는지는 IgG에 대한 형광 접합 항체로 비즈를 염색하여 확인할 수 있습니다.FCM 분석 후, 단클론 항체가 코팅된 비드는 면역침전(IP) 실험에 사용될 때까지 4°C에서 보관할 수 있습니다. 먼저, 비드를 PBS에 1:200에서 1:10,000 비율로 충분히 희석하여 현탁시킨 후 혈구계수기로 수를 셉니다. 각 IP 실험에 사용되는 비드의 수를 정밀하게 제어할 수 있도록 매 준비 배치마다 농도를 측정해야 합니다.다음으로, 물에 2% w/v 농도의 신선한 dig 농축액을 준비합니다. 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 얼음 위에서 냉각합니다.신선하게 조제된 용해 버퍼(lysis buffer)에 1% w/v로 희석하여 넣고 얼음에 보관하십시오. 제시된 표를 가이드라인으로 삼아 용해할 세포 수를 결정하십시오. 단, 필요한 세포 수는 표적 단백질에 따라 달라지므로 실험적으로 결정해야 합니다.여기서는 소림프구 종양 세포주에서 유래한 30 × 10⁶개의 세포를 사용합니다. 필요한 양의 세포 현탁액을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 20,000 ×g에서 세포를 펠렛화합니다.4°C에서 30초 동안 원심분리하고 배지를 흡입하여 제거합니다. 펠릿에 갓 준비한 적절한 양의 Dig lysis buffer를 첨가하고 피펫팅으로 부드럽게 섞어줍니다.그 다음 세포를 얼음 위에서 20분 동안 용해시킵니다. 세포 유형과 연구 대상 단백질-단백질 상호작용에 따라 세포 용해 조건이 달라질 수 있으며, 용해가 완료되었는지는 실험적으로 결정해야 함에 유의하십시오. 용해물을 20,000 ×g에서 원심분리하여 핵과 불용성 세포 잔해를 제거합니다.4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 표적 단백질을 항체 코팅 비드에 결합시키기 위해 상층액(SNA)은 보관하고 펠렛은 제거합니다. 맑게 정제된 용해물에 50,000~250,000개의 단클론 항체 결합 비드를 조심스럽게 피펫팅하여 첨가합니다.단일 IP에 사용되는 용해물(lysate)의 최소 혼합 부피는 5 µL입니다. 정제된 용해물과 비드 혼합물을 4시간에서 하룻밤 동안 콜드룸 내의 회전식 수직 휠(rotating vertical wheel)에 둡니다. 이때 비드가 가라앉지 않도록 충분한 속도로 설정하되, 회전 중에 액체가 튜브 바닥에 머무를 수 있는 수준으로 조절합니다. 이어서 표적 단백질을 IP 항체에 결합시킵니다.면역 복합체를 형광 표지합니다. IP 비즈를 1 mL의 ice-cold FCM 버퍼로 2회 세척하며, 4 °C에서 20,000 ×g로 3분간 원심분리합니다. 매 세척 후, 비즈를 100 µL의 FCM 버퍼에 다시 현탁하고 20 µL씩 5개 이상의 튜브에 분주합니다.1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브 또는 원추형 바닥 플레이트 웰을 준비합니다. 두 가지 모두 여기에 제시되어 있습니다. 샘플에 형광색소 접합 단클론 항체를 첨가합니다.제조사의 지침을 따르거나 경험적으로 결정된 농도를 시작점으로 하여 FCM 염색을 수행합니다. 튜브 또는 웰당 최소 0.1 mg/mL 농도의 항체 스톡 용액 0.2~1 µL를 첨가하고 얼음 위에서 40분 동안 배양합니다. 1.5 mL 튜브에 담긴 프로브 처리된 비드를 1 mL의 차가운 세척액으로 두 번 세척합니다.FCM 버퍼를 넣고 4°C에서 20,000 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 각 세척 단계 후에는 비드를 건드리지 않도록 주의하며 상층액을 조심스럽게 제거합니다.또는, 치민이(chimney) 형태의 경우, 0.2 milliliters의 얼음처럼 차가운 FCM buffer로 바닥 플레이트를 두 번 세척하며, 이때 4 °C에서 1000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 세척 시마다 이 과정을 반복하십시오. 비드에서 상층액을 제거하려면 플레이트를 한 번 튕긴 다음, 뒤집힌 상태 그대로 웰 가장자리에 맺힌 방울을 닦아냅니다.비드가 포함된 각 웰의 잔여 부피는 약 20 µL가 됩니다. 샘플당 200 µL의 FCM 버퍼에 비드를 현탁하여 라벨이 부착된 fax 튜브로 옮깁니다. 이제 샘플을 Becton Dickens 유세포 분석기에서 유세포 분석(flow cytometry 또는 FCM)할 준비가 되었습니다.시료 주입구 또는 흡입구(sip)를 둘러싸고 있을 수 있는 액적 방지 슬리브를 제거하십시오. 시료 간 오염을 방지하기 위해 시료를 채취하는 사이에 흡입구에서 액적이 떨어지도록 하십시오. 여기서 사용되는 CML 비드는 직경이 3~5 µm이며, 이는 정지 상태의 마우스 림프구 직경의 약 절반 크기입니다.따라서 비드 이벤트 집단이 사이토미터에 등록되기 위해서는 전방 산란광(forward scatter) 앰프 게인과 측방 산란광(side scatter) 전압을 수동으로 높여야 할 수도 있습니다. 이를 위해 여기서는 표지되지 않은 비드 또는 블랭크 비드를 사용합니다. 판독 전, 비드, 더블릿(doublet) 및 데브리(debris)를 제외하도록 게이트 설정을 조정합니다.실험 샘플을 통해 형광이 적절한 스케일 내에 있는지 확인합니다. 표지되지 않은 비드는 형광의 음성 대조군으로 사용되며, rainbow calibration particles(RCP)는 형광의 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다. RCP는 CML 비드보다 크기가 작기 때문에, 해당 샘플의 경우 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터와 게이트 위치를 일시적으로 조정해야 할 수 있습니다.이러한 보정을 마친 후, 음성 및 양성 형광 극값은 로그 축상에 시각화됩니다. RCP를 이용한 보정이 완료되면 전방 및 측방 산란(forward and side scatter)을 위해 라벨이 없는 비드 설정으로 되돌아갑니다. 여기에서 보여주는 실험과 같이 샘플당 하나의 형광 프로브만 사용하는 경우에는 형광 보정(fluorescence compensation)이 필요하지 않습니다.이제 형광 데이터 파일을 획득하여 저장하며, 이후 CellQuest 또는 FlowJo와 같은 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 분석을 수행합니다. 다음은 1% digitonin 내의 마우스 T세포 용해물(LY)에 대한 IP FCM 분석 결과입니다. TCR CD3 비단백질 복합체는 anti-CD3 epsilon 비드로 침강시켰습니다.포획된 복합체에는 상당량의 TCR beta 및 이와 연관된 CD3 epsilon이 포함되어 있습니다. 무관한 면역글로불린 프로브 또는 TH1.2, CD45, H2-K `${K D}` 단백질에 대한 항체를 사용하여 분석한 결과, 다른 단백질들은 배경 수준에 가까운 수치로 검출되었습니다. 면역침전 후 웨스턴 블로팅을 수행하는 것과 같은 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 장점은, I-P-F-C-M을 통해 유전자 공학적 기법이나 대량의 시료 없이도 천연 단백질-단백질 상호작용을 평가할 수 있다는 점입니다. I-P-F-C-M은 적은 부피와 낮은 농도의 분석물로도 수행 가능하므로, 분석 가능한 생물학적 재료가 매우 적은 경우에도 높은 신호 대 잡음비를 얻을 수 있습니다.

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IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

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