Name: 고정 볼륨 또는 고정 압력 : 출혈성 쇼크의 Murine 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: 배우세요 생쥐에서 출혈성 쇼크를 유도하는 외과적 방법으로 저혈량성 쇼크에 대한 면역학적 반응과 장기 기능 변화를 특성화합니다. 이 기법은 연속적인 생리학적 모니터링을 통해 정확한 데이터를 제공합니다.

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출혈성 쇼크 GM053789의 기금 소스 / 번호 분자 생물학

1. 악기, 외과 필드 준비 : 1. 악기 준비. 모든 수술 절차는 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. 수술 블루 패드 및 살균 필드 드레싱이 사용됩니다. 모든 자료와 악기를 사용하기 전에 소독 수 있습니다. 6-0 봉합사, 면화 팁 applicators, 거즈, 남성 남성 3 방향 stopcocks, 그리고 악기 압력솥 소독하고 있습니다. 트랜스 듀서, PE - 50, 그리고 PE - 10 튜브는 산화 에틸렌 멸균 수 있습니다. 모든 3 방향 stopcocks, 주사기와 바늘은 멸균 접수하고 있습니다. 6-0 봉합사는 1 인치 조각 (6 개 / 동물)로 잘라 작은 살균 파우치 안으로 들어가게된다. 커튼 - 팁 applicators, 4X4의 거즈 사각형, 그리고 남성 남성 3 방향 stopcocks는 작거나 중간 크기의 살균 파우치와 autoclaved도 넣고. 우리 수술 악기 압력솥 매일 저녁 소독하고 있습니다. 그들은 항균 비누와 수돗물을 사용하여 수술 후 씻어입니다. 그들은 깨끗한 수술 블루 패드에 건조 사용할 수 있습니다. 그들은 다음 조심스럽게 살균 주머니에 배치하고 그 다음날 사용하기 위해 소독하고 있습니다. 트랜스 듀서와 튜브는 플라스틱 부품을 가지고 있기 때문에, 그들은 가스, 즉 산화 에틸렌을 사용하여 소독해야합니다. PE - 10 튜브는 5 인치 조각으로 잘라 작은 살균 주머니에 배치됩니다. PE - 50 튜브는 18 인치 조각으로 잘라 중간 살균 주머니에 배치됩니다. 2. 외과 분야. 외과 분야를 설정하려면, 먼저, 그것이 수술을 시작하기 전에 적절한 온도 300-350 ° F에 도달하기 위해 핫 비드 살균기 켭니다. 그렇다면 알코올에 수술 블루 패드를 배치하여 다음 단계로 진행하면 benchtop을 냈다. 하나의 패드는 현미경으로가는 그리고 다른 하나는 BP 분석기이있는 순환 가열 패드에갑니다. 두 수술 블루 패드 위에 드레싱 멸균 필드를 배치합니다. 70 % 알코올로하는 방법의 스테인레스 스틸 악기 트레이 1 / 3 입력합니다. 모든 수술기구를 커버하기에 충분한 70 % EtOH을 사용합니다. 별도의 멸균 드레싱 필드를 사용하여 현미경 옆에 그것을 놓으십시오. 이 멸균 분야의 모든 멸균기구, 봉합사, 거즈 및 카테터를 삽입합니다. 그들을 만져을 오염하지 마세요 살균 악기와 봉합을 열 때주의하십시오. 이 설치 절차를 수행할 때 멸균 장갑을 사용하는 것이 좋습니다. 2. 기계 설정 및 절차 : 1. 카테터 - 설정합니다. 하기 위해 멸균 장갑을 끼도록 BP, 먼저, 측정하는 데 사용되는 오른쪽 다리 murine 카테터를 설정합니다. 그런 다음 autoclaved 주머니에서 멸균 PE - 10 튜브를. 포인터 손가락과 그들 사이 인치에 대해 떠나는 엄지와 튜브의 가운데를 잡아. 튜빙의이 섹션 카테 테르 삽입에 도움이 직경이 얇은 수 있도록 아주 조금 스트레칭. 스트레칭 후 튜브는 멸균 가위를 사용을 반으로. 5 인치 튜브 지금 ½ 인치 길이의 약 2 두 조각해야합니다. 베벨 늘어 종료를 확인하십시오. 이것은 선박 벽 아래쪽으로 파고하여 루멘을 종료의 가능성을 높일 수 있으므로 * 너무 beveled 가장자리를 각도를하지 마십시오. 튜빙의 무딘 unstretched 끝에 30G 바늘을 삽입합니다. 살균 1cc 주사기와 3 방향 꼭지를하십시오. 알코올이 heparinized 생리 식염수 (0.1ml Heparin/9.9ml 살린)이있는 10cc 멸균 유리병 상단을 소독하기 위해 닦아 사용하십시오. 헤파린 솔루션 0.6 - 0.7cc와 주사기를 채우십시오. 남성 끝 건너편 직접하는 3 방향의 끝에 30G 바늘과 카테터를 첨부합니다. 꼭지, 30G 바늘과 헤파린 솔루션 PE - 10 튜브를 입력합니다. 시스템의 모든 공기 방울을 얻을해야합니다. 모든 기포를 제거하는 가장 효과적인 방법은 중력을 이용하는 것입니다. benchtop에 튜브의 매달려을 보내는 동안 지상쪽으로 바늘을 가리 킵니다. 바늘 허브에게 손가락의 제스처를주고 거품이 헤파린 솔루션의 위로 떠 것입니다. 3 방향에서 30G 바늘을 제거하고 거품을 제거하십시오. 3 방향에 갇혀있는 모든 거품을 제거하고 3 방향으로 튜브를 다시 연결하는 1cc 주사기로 3 방향 뒤쪽에 액체를 철회. 혼합물의 약 1cc는 주사기에 남아합니다. 마우스 1U 헤파린 / 마우스에 대한 동등이 혼합물의 0.05cc (삽입시 명백을 유지하기 위해 카테터 플러싱의 결과로)에 대한 받게됩니다. 수술 악기 드레싱 멸균 분야에이 완료된 카테터를 삽입하십시오. 하기 위해 설정 왼쪽 다리 murine 카테터는 3 방향 꼭지를 제외하고 위에서 설명한 것과 같은 절차를 따르십시오. 왼쪽 다리는 혈액을 그리는 데 사용되며 3 방향 꼭지가 필요하지 않습니다. heparinized 생리 혼합물의 0.15 - 0.2cc 다른 살균 1cc 주사기를 입력합니다. 30G의 바늘과 PE - 10 tubi 소개 시켜줘1cc 주사기로 직접 NG. 솔루션이 왼쪽 다리의 카테 테르 시스템을 채우십시오. 역시,이 시스템에서 거품을 제거합니다. 멸균 악기 드레싱 멸균 분야에 완성된 카테터를 놓습니다. 2. 변환기 - 설정합니다. 마이크로 의대 사양에 따라 digi - Med가 BPA 400 분석기에 살균 변환기를 가져와. 변환기의 양쪽에 3 방향 꼭지를 부착합니다. Lactated 링어 솔루션 (LR)와 10cc 주사기를 기입하고 변환기가 benchtop에 평평하게 누워 있도록 3 방향에 첨부해 주시기 바랍니다. PE - 50 튜브 18 인치 presterilized precut의 조각의 양쪽에 23G 바늘을 삽입합니다. 10cc 주사기 붙어있는 3 방법 PE - 50 튜브의 한쪽 끝을 연결합니다. LR과 PE - 50 설정 3 방향과 정보를 입력합니다. 로 이전 섹션에서 설명한 시스템의 모든 공기 방울을 얻을해야합니다. 변환기에 3 방법을 다시 첨부하고 변환기 및 2 차 LR 3 - 방법을 입력합니다. 마지막으로, 오른쪽 다리 murine 카테터로 첨부 파일에 대한 PE - 50 튜브의 23G 바늘로 금속 남성 남성의 뜨거운 맛을 잠금 꼭지를 첨부합니다. * 그 때 작동 유체가 변환기에 남아있는 것이 중요합니다. * 교정과 마이크로 메드 프로토콜에 따라 제로 절차를 따르십시오. 3. 수술 및 실험 절차 : 1. 외과 절차. Pentobarbitol 나트륨의 intraperitoneal 주사 (Nembutol) (70mg/kg @ 1시 10분 희석)을 관리하여 시작합니다. 이 절차는 꼬리의 기지를 (대부분의 근위 끝)를 사용하여 자사의 케이지에서 마우스를 데리러 먼저에 의해 수행됩니다. 여전히 꼬리를 누른 상태 다음은 새장의 상단에있는 동물을 놓으십시오. 그냥 forepaws 뒤에 마우스의 양쪽 엄지와 가운데 손가락으로 마우스의 목 아저씨를 잡아. 검지 손가락은 머리를 고정하는 아저씨쪽으로 다시 머리 / 목 지역에있는 피부를 당겨하는 데 사용됩니다. 손가락이 마우스의 척추의 요추에 누르고있는 동안 마우스의 꼬리는 다음 포장해서 작은 손가락과 손가락 사이에 개최됩니다. 마우스가 5 분 이내에 잠이해야합니다. 동물 후 anesthetized 장소 그들을 위로 향한 위치에 금속 플레이트 수술에 있습니다. 느슨한 루프 테이프 기술들은 사지를 녹화하여 동물을 고정하는 데 사용됩니다. 느슨한 루프 기술은 단순히 테이프 얇은 스트립을 절단하고 웃기고 열등 포어 사지의 각 주위와 웃기고 열등 뒷다리 사지의 각 주위에 느슨하게 테이프를 포장 알아볼 수 있습니다. 테이프 그런 다음 자체로 붙어 있으며, 테이프를 통해 왼쪽은 보드에 첨부되어 있습니다. 이것은 생쥐의 사지가 더 자연스러운 해부 위치를 가정 수 있습니다. 동물의 복부와 사타구니 영역은 다음 오스터 A5의 가위 크기 40 블레이드를 사용하는 면도있다. 4X4의 거즈는 betadine 함께 묻은 거 같아요이고 수술 영역이 다음 불임에 대한 닦아입니다. 고정 및 살균 후, isoflurane의 1cc와 코 콘은 초기 절개를하기 전에 몇 초 동안 마우스의 코 위에 배치됩니다. 코 콘은 거즈로 가득 50cc 원뿔 튜브로 구성되어 있습니다. 튜브의 아래쪽 절반은 연락도없이 내부의 나머지 부분에 마우스의 코에있는 공간을 만드는 잘라입니다. 모자 (조직 스토리지 컨테이너의 하단)은 isoflurane 증기가 탈출하지 않도록하기 위해 50cc 원뿔의 끝부분에 배치됩니다. 동물의 호흡이 느린 시작되면, 작은 4~5mm 절개는 복부와 왼쪽 가로 abdominus 근육의 왼쪽 내부 경사 근육에 평행하게 피부에 이루어집니다. 대퇴 정맥과 동맥의 해부은 다음과 같습니다. 주변 근육이나 터치 신경을 손상하지 않도록하십시오. 이 해부를 시작하려면 복부 연결에서 dumonts과 지방 조직을 잡아하여 경사와 가로 복부 근육에서 지방 조직을 구분합니다. 멀리 근육 벽에서이 조직을 당겨. 그런 다음, dumonts의 다른 쌍을 사용하여 근막과 지방 조직을 멀리 괴롭히고 복부 근육을 따라 절개하다을 둔하게. 이번 지방 조직 아래의 대퇴 신경와 함께 대퇴 정맥과 동맥을 거짓말. * vastus intermedius, medialis 및 quadriceps femoris 또는 rectus femoris의 lateralis의 근육을 손상하지 않도록주의하십시오. 이 근육을 잡아하거나 만질 필요도 정말 없습니다. * 대퇴 신경을 만지지 마십시오 그 옆에 자리잡고 지방 조직을 잡아서 신경 멀리 해부하다. 정맥과 동맥에서 옆으로이 조직을 당겨하고이 조직에 포함된으로 신경이 따를 것입니다. 신경이 옆으로 당겨 있듯이, 동맥에 대한, 포인트 아래 다른 dumonts를 삽입하고 열고 그들을 폐쇄하여 근막을 절개하다 퉁명스러운. 못 반드시 혈관은 매우 피상적​​ 아르기본 근육으로 파고. 신경이 분리되면 근육에 혈관을 쥐고있는 근막을 분리 dumonts을 사용합니다. dumonts 감아과 혈관에 dumonts의 지느러미를 슬립. dumonts의 끝은 정맥의 반대쪽에 나타나는대로, 그들이 근막을 절개하다 무딘을 엽니다. 선박에 dumonts의 지느러미를 유지하고 첫 번째 치료를 잡아. dumonts에 봉합사를 넣고 혈관과 근육 사이에 만들어진 기본 개통을 통해 다시 치료를 가져옵니다. 다시 말하지만, 모든 주위의 근육을 손상시킬 필요가 없습니다. 정맥과 동맥 주위에 3 총 6-0 봉합 놔. 봉합사 1 복부 근육에 가장 근위입니다. 으로 매듭을 짓고 있지만 풀과 hemostat 그만 두십시오. hemostat의 오목한 가장자리는 동물의 복강에 휴식한다. 봉합사 2 위치에서 가장 말초입니다. 이 봉합사는 즉시 아래로 다시 혈관과 hemostated, 오목한 면을 ligating에서 묶었 수 있습니다. 말초 및 근위 봉합은 긴장된 혈관 (혈액 손실을 방지하기 위해) 뽑아 그들에게 카테 테르 삽입에 도움을 조금 리프트하는 데 사용됩니다. 봉합사 3 카테 테르 지원 봉합입니다. 말초 및 근위 봉합 사이 치료를 놓습니다. 삽입 후 혈관 안쪽에 카테터를 확보하는 데 사용됩니다 느슨한 매듭을 묶어. 봉합은 안전 후에 두꺼운 그릇 벽에 의해 동맥을 식별합니다. 아주 흰색이다. microscissors를 사용하여 동맥의 상단에 작은 절개를합니다. 초기 카테 테르 삽입에 대한 동맥의 충분한 금액이 때문에 말초 봉합이 구멍을 가까이하십시오. 동맥 혈관의 루멘에 dumonts의 한쪽 끝을 배치하고 선박 벽 위에 그들을 폐쇄하여 구멍을 열 수있는 dumonts을 사용합니다. 그것이 초기 삽입 후 제자리에 카테터를 개최하는 데 사용할 수 있도록 중간 봉합이 동맥 구멍에 근위 있는지 확인하십시오. 카테터를 통해 혈관을 끄는 동안 동맥 벽이 루멘에 카테터를 밀어 누른 상태. 가볍게 제자리에 카테터를 잡아 중간 지원 봉합을 묶어. 근위 hemostat를 놓습니다. 이 릴리스는 근위 봉합을 풀어 혈관 주변의 봉합을 재개합니다. 이 시점에서, 동맥 압력은 카테터에 다시 혈액을 밀어해야합니다. Pulsating 혈액 카테터에 표시되어야합니다. 한 더몬트으로 카테터 주변의 혈관을 잡고 4~5mm에 대한 선박에 카테터를 밀어 상대방을 사용합니다. 카테터 주위의 혈관을 개최하면 동맥의 끊어지고 방지하는 데 도움이됩니다. 카테터의 끝이 내부 경사와 가로 abdominus 근육 아래에 좀 쉬어야한다. 동맥 선의 혈액 응고 방지, 카테터로 혈액을 철회하고 heparinized 유체 달이다하기 위해 마우스로 여러 번 다시 밀어. 양자 대퇴 동맥 cannulation에 대한 다른 다리에 대해이 절차를 반복합니다. 생리적 매개 변수를 모니터하기 위해 동물을 훅, BPA - 400 분석기를 IE와 동맥 라인을 플러시. 주변 조직 촉촉한을 유지하기 위해 수술 여는 멸균 생리에 1 또는 2 방울을 넣어. 절차를 통해 포화이 지역을 계속해야합니다. 불임을 유지하기 위해 절차를 통해 동물을 통해 드레싱 멸균 필드를 배치합니다. 70 % 알코올로 수술 도구를 삽입하고 멸균 거즈로 그들을 닦으십시오. 동물 사이의 살균을위한 ~ 20 초 동안 뜨거운 비드 살균기에 넣어 두었어요. 수술 도구를 제거하고 그들을 식히고 수 있도록 70 %의 알코올을 스프레이. 멸균 패드에 그들을 놓으십시오. 다음 동물에 다시 똑됩니다 악기에 남아있는 알코올이없는 있는지 확인합니다. 2. 출혈성 쇼크. 15 분 이상. 기간은 약 1 / 2 마우스의 혈액 볼륨의는 28~32mm HG의 뜻 동맥 압력을 달성 철회합니다. * 25-27그램 마우스에 원하는 압력을 달성하기 위해 철회 혈액의 초기 부피는 약 0.6cc이다 이 절차는 고정 볼륨 반대로 고정 압력 방식입니다. 이러한 절차는 그러나 고정 압력 및 고정 볼륨 출혈 모두 따라 수 있습니다. 지속적으로 모니터링하면서, 동물은 1.5 3시간에 대한 출혈성 쇼크에 남게됩니다. 원하는 압력을 달성하기 위해 더 많은 혈액을 철회 동물은 보정을 시도하고 의미 동맥 압력 (BP / HR 분석기를 통해 볼 수) 약간 다시 상승 시작으로. 보조제 (0.05cc Nembutol의 IP)가 거의 사상 HS 절차 중에 필요하지 않습니다 있지만, 동물의 호흡, 수염 운동, 반사 검사, 그리고 디지털 BP / HR 독서는 동물 마취의 보충이 필요한 시기를 결정하는 데 도움이됩니다. 동물 램프 아래와 36-37의 온도를 유지하는 데 도움을 순환 가열 패드에 보관됩니다 ° C 출혈성 쇼크 절차를 통해. 온도는 직장 프로브를 통해 확인합니다. 3. 소생. 충격 시간 elaps 후말이지, 동물은 Lactated 링거스 (LR) 배 각 동물의 창고 혈액 볼륨의 고정 볼륨에서 솔루션을 사용하여 (R) resuscitated입니다. LR 볼륨이 일정한 비율, 15 분 이상의 볼륨에서 분배로 설정 주사기 펌프를 통해 관리합니다. 간격. 카테 테르를 제거하고 3 봉합을 사용하여 혈관을 ligate. 그냥 근위 봉합 과거 카테터를 당겨와 완전히 단절이 치료를 찾아낸다. 그것은 혈액 손실을 방지할 수 있습니다. 담보 흐름은 허혈성되는 것을 뒷다리 사지를 방지할 수 있습니다. 4. Rescitation를 게시합니다. R 후 두 뒷다리 사지 입구는 무균 4-0 PDSII의 봉합사를 사용하여 수놓은 수 있습니다. 느슨한 루프 테이프가 제거되고 동물은 몇 시간 포스트 복구를 위해 순환 가열 패드에 보관 깨끗한 케이지에 넣습니다. 동물이 정상적으로 통증을 관리하기 위해 마취에서 waken 시작으로 진통을 관리해야합니다. Buprenorphine은 동물들이 신체 활동을 시작으로 (0.1mg/kg) subcutaneously 주입 아니지만 전에 않도록 호흡 기능을 손상하지 않습니다. IACUC 승인된 프로토콜, 개별 동물 행동, 그리고 현재의 의료 조건에 의해 보증 등 적극적인 게시물 수술 모니터링의 사용을 권장합니다. 4. 성공을위한 비밀 : <ol><li> 혈관 해부하면, 대퇴 신경을 터치하지 않도록 </li><li> rectus lateralis rectus femoris의, 그리고 vastus medialis 근육을 손상하지 않도록주의하십시오. 이 근육을 잡아하거나 만질 필요도 정말 없습니다. </li><li> 이번처럼 너무 날카로운 카테터의 베벨의 각도를 사용하지 마십시오하면 루멘과 통제 출혈이 종료 카테터으로 이어질 것입니다 </li><li> 최대한 무균 상태로 여분의 노력을해야합니다. </li><li> 카테 테르 또는 변환기 시스템의 모든 부분에 공기 방울이 없습니다 있는지 확인합니다. </li><li> 그것이 작동하는 동안 변환기에서 LR 오일을 가지고 있는지 확인하십시오. 드리 룬은 BP 시스템을 손상 수 있습니다. </li><li> 동맥 구멍이 작은합니다. </li><li> 말초 봉합사에 가까운 동맥 구멍을 확인하십시오. </li><li> 동시에 동맥을 추출 방지하기 위해 카테터 삽입에 대한 그 위에 혈관을 끄는 동안 카테터를 밀어. </li><li> 통제 조직 손상 또는 유체의 손실을 방지하기 위해 무균 식염수에 포화 다리에 수술 구멍을 유지해야합니다. </li><li> 인내와 기교가 중요합니다. </li><li> 실험을 통해 동물의 생리에주의를 닫습 지불합니다. </li></ol> 5. 수술의 우려를 게시 : <ol><li> 다리에 국소 빈혈이 있는지 확인합니다. 부수적인 흐름이되지 않도록해야하지만. </li><li> 동물은 수술 조작과 관련된 염증의 결과로 뒷다리 팔다리를 사용하여 문제가 수 있습니다. 적절하게 고통을 관리합니다. </li><li> 감동 이후에 신경을 손상하는 것은 동원하기 위해 동물의 무능력을 초래할 수 있습니다. </li></ol>

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동물 실험 감독과 지침 및 규정 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 규정된 및 연구 실시와 피츠버그 대학의 준수 사무실, 완전 공인 AALAS / AALAC 기관에 따라 수행되었다. 동물 소스 잭슨 연구소와 찰스 리버스 연구소를 포함합니다. 모든 동물은 광범위한 건강 각 업체를 통해 보증뿐만 아니라, 피츠버그의 내부 동물 건강 모니터링 프로그램의 대학을 받고있다. 이 연구는 척추 동물의 사용에 대한 미국 정부의 원칙에 따라 실시됩니다. 이 프로그램은 USDA에 등록하고, 실험실 동물 복지의 보건 서비스 사무소와 보증의 편지를 가지고있다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 기계 </th><th> 제조 업체 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Dumonts (SS/45 각도 0.2x0.12mm - 팁, 13.5cm 길이) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11203-25 </td></tr><tr><td> 외과 가위 (직진 - 12cm) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 14068-12 </td></tr><tr><td> Hemostats (곡선 - 12.5cm) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 13009-12 </td></tr><tr><td> Microscissors (봄 가위 - 직진 - 8cm) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> 포셉 (0.8mm - 팁, 곡선 - 10cm) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 11050-10 </td></tr><tr><td> 봉합사 릴 6-0 </td><td> 파인 과학 도구 </td><td> 18020-60 </td></tr><tr><td> 봉합 4-0 PDSII </td><td> 펜 베트 </td><td> ETHZ304H </td></tr><tr><td> 거즈 4X4 </td><td> 모든 글로벌 업체를 통해 구입하실 수 있습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 목화 - 팁 작은 주걱 </td><td> 모든 글로벌 업체를 통해 구입하실 수 있습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 30G의 바늘 </td><td> 모든 글로벌 업체를 통해 구입하실 수 있습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 23G의 바늘 </td><td> 모든 글로벌 업체를 통해 구입하실 수 있습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 3cc 주사기 </td><td> 모든 글로벌 업체를 통해 구입하실 수 있습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 5cc 주사기 </td><td> 모든 글로벌 업체를 통해 구입하실 수 있습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 10cc 주사기 </td><td> 모든 글로벌 업체를 통해 구입하실 수 있습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 50cc 원뿔 관 </td><td> 모든 글로벌 업체를 통해 구입하실 수 있습니다 </td><td></td></tr><tr><td> 1cc 주사기 W / 25G 바늘 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 14-826-88 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 10 관 100`(PE - 10) </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 14-170 - 12P </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 50 관 100`(PE - 50) </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 14-170 - 12B </td></tr><tr><td> 3 방향 꼭지 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> NC9779127 </td></tr><tr><td> 외과 블루 패드 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 50-7105 </td></tr><tr><td> 무균 필드 드레싱 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> NC9517505 </td></tr><tr><td> 테이프는 &quot;1 롤 </td><td> 기업 익스프레스 </td><td> MMM26001 </td></tr><tr><td> 바로 옆에 넓은 입 단지 (코 콘을 위해 뚜껑으로 사용) </td><td> VWR </td><td> 159000-058 </td></tr><tr><td> 스테인리스 트레이 8 &quot;X 11&quot; </td><td> VWR </td><td> 62687-049 </td></tr><tr><td> 남성 남자의 뜨거운 맛을 잠금 3 웨이 </td><td> VWR </td><td> 20068-909 </td></tr><tr><td> 멸균 파우치 3 &quot;X8&quot; </td><td> VWR </td><td> 24,008 </td></tr><tr><td> 멸균 파우치 5 &quot;X10&quot; </td><td> VWR </td><td> 24,010 </td></tr><tr><td> 와일드 M650 현미경의 W / 붐 스탠드 </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Leica IC D 디지털 카메라 / 라이브 이미지 </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Digi - 메드 BPA - 400 분석기 및 시스템 통합 </td><td> 마이크로 메드 </td><td> SYS - 400 </td></tr><tr><td> TXD - 310 (Digi - 메드 변환기) </td><td> 마이크로 메드 </td><td> TXD - 300 </td></tr><tr><td> 컴퓨터 </td><td> 작은 골짜기 </td><td></td></tr><tr><td> 핫 비드 악기 살균기 </td><td> VWR </td><td> 18000-45 </td></tr><tr><td> 오스터 A5 가위 w 크기 40 블레이드 </td><td> VWR </td><td> 10749-020 </td></tr><tr><td> 순환 heating 패드 18x26 </td><td> 하버드 </td><td> py872 - 5272 </td></tr><tr><td> 직장 온도계 </td><td> 켄트 과학 </td><td> RET - 3 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 집중 </th><th> 제조 업체 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Pentobarbital 나트륨 (Nembutol 나트륨 솔루션) </td><td> 70mg/kg </td><td> 대인기 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorphine HCL </td><td> 0.1mg/kg </td><td> 베드 포드 연구소 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated 링거스 사출 250cc IV 가방 </td><td> 백스터 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aerrane (Isoflurane) </td><td> 99.9 % </td><td> NLS 동물 건강 </td><td> 105996 </td></tr><tr><td> 헤파린 나트륨 </td><td> 1000U </td><td> Abraxis </td><td></td></tr><tr><td> 정균 나트륨 염화물 </td><td> 0.9 % </td><td> Hospira </td><td></td></tr><tr><td> 에틸 알코올 </td><td> 70% </td><td> Pharmaco - AAPER </td><td></td></tr><tr><td> Triadine Povidone의 요오드 (Betadine) </td><td></td><td> 깡패 disposables </td><td></td></tr></tbody></table>

고정 볼륨 또는 고정 압력 : 출혈성 쇼크의 murine 모델

Fixed Volume or Fixed Pressure: A Murine Model of Hemorrhagic Shock

그것은 심각한 혈액 손실 및 외상성 부상이 (MOD 이러한 신호 이벤트는 또한 패혈증 및 / 또는 여러 장기 부전으로 이어질 수있는 자주 사망률의 결과 유해 신호 사건의 케스케이드. 1, 2, 3, 4, 5를 가져올 수있는 상식이다 ). 6, 7, 8, 9는 외상성 부상에서 고통받는 환자를 도와 더 효과적인 방법을 개발하기 위해 억압 면역 기능과 해로운 신호 폭포의 원인을 조사 후 중요합니다. 10이 고정 압력 출혈성 충격 (HS)는 절차는 기술적으로 도전하지만, 이러한 pathophysiologic 조건의 조사를 위해 훌륭한 리소스입니다. 11, 12, 생물 학적 시스템의 평가 13 진보 즉, 시스템 생물학 더 복잡한 physiologic 네트워크와 셀룰러 통신 패턴을 이해하기 위해 과학적인 커뮤니티를 활성화했습니다. 14 출혈성 쇼크들은 면역 기능과 관련된 이러한 셀룰러 통신 패턴을 공개를위한 중요한 도구로 입증되었습니다. 15, 16, 17, 18이 절차는 마스터 할 수 있습니다! 이 절차는 고정된 볼륨 또는 고정 압력 접근 방식 중 하나로서 사용할 수 있습니다. 우리는 타고난과 적응 면역 기능에 연구를 향상시키는 murine 모델에서이 기술을 적응. 생쥐에서 작은 크기로 인해 HS 19, 20, 21 독특한 도전을 선물한다. 많은 사용 가능한 마우스 종자로 인해 그러나,이 종족은 생물 학적 반응의 연구를위한 최고의 리소스를 나타냅니다. HS 모델은 충격 다른 형태의 차이가 서로 다른 반응을 elicits 같은 셀룰러 통신 패턴과 같은 호르몬과 염증 중재자 시스템, 위험 신호, 즉 습기 및 PAMP upregulation과 같은 시스템의 반응을 연구에 중요한 모델입니다. 22, 23 , 24, 25 유전자 변형 murine 종자의 개발과 구체적인 신호를 억제하는 생물 학적 요원의 유도 더욱 심각한 혈액 손실, 즉 HS 및 외상 26 후 신호 전달의 조절을 위 우리의 이해를 명료하게하다하고 귀중한 기회, 27를 발표했습니다 , 28, 29, 30. HS 및 외상과 공동으로 수많은 인공 호흡 방법은 (R)가 있습니다. 31는, 32, 33, 34 세 번 헛간 혈액 볼륨과 동일 전적으로 lactated 링어 솔루션 (LR)의 고정 볼륨 인공 호흡 방법이 모델에서 사용 같은 원격 장기 부상 체계 염증으로 내생 메커니즘을 연구하기 위해 서요. 소생의 35, 36, 38이 방법은 HS 및 외상 38, 39의 효과를 평가에 효과적일 수있다.

출혈성 쇼크 모델은 외상 후 염증 및 최종 장기 손상과 관련된 신호 폭포의 식별 및 이해를 용이하게 안정적이고 재현성 자원을했습니다. 이 문서는 생쥐의 출혈성 쇼크 실험 절차와 관련된 수술 및 기계적 측면의 단계별 설명을 제공합니다.

고정 볼륨 또는 고정 압력 : 출혈성 쇼크의 Murine 모델

심각한 출혈과 외상성 손상이 해로운 신호 전달 사건의 연쇄 반응을 일으켜 흔히 사망으로 이어질 수 있다는 것은 잘 알려진 사실입니다. 1, ...

저혈량성 쇼크에 대한 면역 반응을 특성화하기 위해, 마우스의 혈관을 절개하고 카테터를 삽입하는 외과적 수술을 수행합니다. 디지털 기록과 육안 관찰을 통해 동물의 생리적 상태를 모니터링하는 동안, 유도된 쇼크 이후의 외상 경험을 모사하기 위해 출혈성 쇼크를 유도합니다. 이후 마우스를 소생시키고 카테터를 제거한 뒤 동물이 회복될 수 있도록 합니다.이후 유세포 분석법, 혈액학적 분석, 면역 블롯, 면역 조직 화학 분석 또는 유전자 칩 마이크로어레이와 같은 다양한 기술을 통해 장기 기능의 변화, 세포 간 통신 패턴 및 유전자 발현을 평가하기 위해 마우스를 연구할 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 일정 부피 또는 일정 압력의 출혈성 쇼크 모델을 통해 연구자가 생리적 변동을 지속적으로 모니터링하고 정확하게 기록하면서 쇼크의 정도를 조절할 수 있다는 점입니다. 이러한 특정 출혈성 쇼크 방법은 수술 준비 과정에서 면역 기능을 연구하고 이해하는 연구자의 능력을 향상시킵니다.다음의 멸균 장비 및 소모품이 준비되어 있는지 확인하십시오. 6-0 봉합사, 면봉 및 팁 도포기, 거즈, 3방향 스톱콕 트랜스듀서, 18인치 길이의 PE 50 튜브 및 5인치 길이의 PE 10 튜브가 필요합니다. 필요한 수술 도구는 3방향 스톱콕, 1 cc 주사기, 10 cc 주사기, 23 gauge 바늘, 30.5 gauge 바늘, 미세 가위, 미세 핀셋, 수술용 패킷, 핀셋, 지혈 겸자 및 수술용 가위입니다.추가 준비물로는 젖산 링거액과 알코올 솜이 있습니다. 금속 보드, 멸균 구역, 멸균 장갑, 베타딘, 멸균 식염수, 헤파린 처리된 식염수 및 마취제가 필요합니다. 수술 당일, 멸균 장갑을 착용한 상태에서 혈압 측정에 사용되는 우측 다리 미러링 카테터를 설치하십시오.약 5인치 길이의 멸균 PE 10 튜빙의 중앙 부분을 양손으로 잡고 약 1인치 정도 늘려 카테터 삽입이 용이하도록 합니다. 멸균 가위로 튜빙을 반으로 자르되, 늘어난 끝부분은 비스듬하게 자릅니다. 그다음 늘어나지 않은 PE 10 튜빙의 뭉툭한 끝부분에 30게이지 바늘을 삽입합니다.알코올 솜을 사용하여 헤파린 식염수가 들어 있는 10 cc 멸균 바이알의 상단을 소독합니다. 1 cc 주사기에 헤파린 용액 0.6~0.7 cubic centimeters를 채웁니다. 3-way의 수컷 단자와 정반대편 끝에 30 gauge 바늘과 카테터를 부착합니다.스톱콕 30게이지 바늘과 PE 튜브에 헤파린 용액을 채우고 공기 방울이 없는지 확인합니다. 톡톡 쳐서 공기 방울을 제거한 다음, 3-way 스톱콕에서 30게이지 바늘을 제거하고 1 CC 시린지로 액체를 다시 흡입하여 3-way 내부에 갇힌 공기 방울을 제거한 후, 튜브가 연결된 바늘을 다시 부착합니다. 시린지에는 혼합액이 약 0.1 cubic centimeters 남아 있어야 합니다.왼쪽 다리 미러링 카테터를 설치하려면, 3방향 스톱콕을 제외하고 방금 설명한 절차를 따르십시오. 먼저 젖산 링거액 백을 알코올로 닦아냅니다. 그다음 micro me 사양에 따라 멸균 트랜스듀서를 혈압 및 심박수 측정기에 연결합니다.다음으로, 트랜스듀서의 양 끝에 3방향 스톱콕을 연결하고 실험대 위에 평평하게 놓습니다. 10 cc 주사기에 젖산 링거액을 채워 3방향 스톱콕에 연결합니다. 18인치 길이의 멸균 PE 50 튜브 양 끝에 23게이지 바늘을 삽입합니다.PE 튜브의 한쪽 끝을 10 cc 시린지가 연결된 3방향 콕(three-way)에 연결합니다. 그런 다음 3방향 콕과 PE 50 장치를 젖산 링거액으로 채웁니다. 이전과 마찬가지로 모든 공기 방울을 확실히 제거하십시오.다음으로, 3방향 콕을 트랜스듀서에 다시 연결하고 채웁니다. 그리고 두 번째 3방향 콕을 젖산 링거액으로 채웁니다. 마지막으로, 금속제 수컷-수컷 루어 락 스톱콕을 PE 50 튜빙의 23 gauge 바늘에 연결하여 우측 다리 미러링 카테터에 부착합니다.이제 기구들이 준비되었으므로, 쇼크 유도를 위한 준비 단계로서 마우스의 혈관을 박리하고 카테터를 삽입하는 수술 및 실험 절차를 진행합니다. 먼저 sodium pentobarbital로 마취된 마우스를 금속 수술판 위에 놓습니다. 마우스를 배와 위로 향하게 한 상태에서, 발 아래쪽 사지의 각 부위에 얇은 테이프 조각을 느슨하게 감아 판에 고정하는 느슨한 루프 테이프 기법(loose loop tape technique)을 사용하여 동물을 고정합니다. 40번 날이 장착된 osteo a five 클리퍼를 사용하여 동물의 복부와 서혜부 영역을 제모합니다.그 다음 거즈를 사용하여 베타딘과 알코올로 해당 부위를 닦아 멸균합니다. 1 cm³의 플루오린이 충전된 노즈 콘을 마우스의 코 위에 덮어줍니다. 동물의 호흡이 느려지기 시작하면, 사지 신전 회피 반사를 이용하여 마취 깊이를 확인합니다.멸균 상태를 유지하기 위해 시술 전 과정 동안 동물 위에 멸균 필드 드레싱을 덮어 둡니다. 그런 다음 복부의 왼쪽 내복사근과 왼쪽 복횡근에 평행하게 피부에 4~5 mm의 작은 절개를 가합니다. 이때 주변 근육이 손상되거나 신경이 닿지 않도록 주의합니다.dumont 핀셋을 사용하여 복부 연결 부위의 조직을 잡고, 외복사근 및 복횡근에서 지방 조직을 분리합니다. 다른 한 쌍의 둔단 핀셋(blunt dissection forceps)을 사용하여 복근을 따라 둔성 박리를 수행하며 근막과 지방 조직을 떼어냅니다. 이 지방 조직 바로 아래에 대퇴정맥 및 대퇴동맥와 대퇴신경이 위치하는데, 대퇴신경을 건드리지 않도록 주의하며 신경 옆에 있는 지방 조직을 잡아 대퇴신경을 박리합니다.이 조직을 정맥과 동맥으로부터 외측으로 당깁니다. 이 조직에 매몰되어 있는 신경은 신경이 외측으로 당겨짐에 따라 함께 따라오게 됩니다. 다른 dumont 핀셋의 끝을 동맥에 대고 집게를 열고 닫습니다.근막을 둔성 박리합니다. 혈관이 매우 표층에 위치하므로, 하부 근육층까지 깊게 파고들지 않도록 주의하십시오. 신경을 분리한 후, dumont 핀셋을 닫은 상태로 유지하며 혈관의 등쪽으로 밀어 넣습니다.dumont 핀셋의 끝이 혈관 반대편으로 나타나면, 이를 벌려 근막을 둔성 박리합니다. dumont 핀셋을 혈관의 등쪽에 유지하며 첫 번째 봉합사를 잡습니다. 그런 다음 혈관과 그 아래 근육 사이에 만들어진 개구부를 통해 봉합사를 다시 뒤로 당깁니다.정맥과 동맥 봉합 부위 주변에 총 3~6개의 봉합사를 배치합니다. 그중 하나는 복근 결찰 매듭에서 가장 근위쪽에 위치시키되, 느슨하게 둔 상태에서 지혈鉗(hemostat)로 집어 고정합니다. 지혈鉗의 오목한 가장자리가 동물의 복강에 닿도록 합니다.두 번째 봉합사는 위치상 가장 말단에 해당합니다. 혈관을 결찰하기 위해 이 봉합사를 즉시 묶고, 혈관 집게의 오목한 면이 아래로 향하게 하여 고정합니다. 말단 및 근위 봉합사는 출혈을 방지하기 위해 혈관을 옆으로 당기고, 카테터 삽입을 용이하게 하기 위해 혈관을 약간 들어 올리는 데 사용됩니다. 세 번째 봉합사는 말단 봉합사와 근위 봉합사 사이에 배치해야 합니다.카테터 지지를 위해, 삽입 후 혈관 내에서 카테터를 고정하는 데 사용할 느슨한 매듭을 묶습니다. 봉합이 완료되면, 두꺼운 혈관벽과 흰색을 통해 동맥을 확인합니다. 마이크로 가위를 사용하여 원위부 봉합사 근처의 동맥 상단에 작은 절개를 만들어, 초기 카테터 삽입을 위한 충분한 양의 동맥 부위가 확보되도록 합니다.Dumont 핀셋의 한쪽 끝을 동맥 혈관 내강에 넣고, 혈관벽을 잡은 상태에서 혈관벽 위로 핀셋을 닫아 구멍을 엽니다. 혈관을 카테터 위로 끌어당기면서 카테터를 내강 안으로 밀어 넣습니다. 카테터를 고정하기 위해 중앙 지지 봉합사를 가볍게 묶습니다.그런 다음 근위부 지혈鉗(hemostat)를 풀어 근위부 봉합사를 느슨하게 하고 혈관 주변의 봉합 부위를 다시 엽니다. 이 시점에서 동맥압에 의해 혈액이 카테터 내부로 다시 밀려 들어와야 합니다. 카테터 내에서 박동성 혈류가 관찰되어야 합니다.한 손으로 카테터 주변의 혈관을 잡고, 다른 손을 사용하여 카테터를 혈관 내로 4~5 mm 밀어 넣습니다. 카테터의 끝부분은 내복사근과 복횡근 바로 아래에 위치해야 합니다.동물을 BPA 400 분석기에 연결하고 동맥 라인을 세척합니다. 출혈성 쇼크 유도 및 소생 과정 동안 주변 조직이 건조해지지 않도록 수술 부위에 멸균 식염수를 한두 방울 떨어뜨립니다. 먼저 마취된 마우스를 램프 아래와 순환식 가열 패드 위에 놓아 36에서 37 °C의 온도를 유지하도록 합니다.다음으로, 주사기를 사용하여 15분 동안 마우스 혈액량의 약 절반을 추출하여 평균 동맥압을 28 to 32 mmHg로 유지합니다. 1.5 to 3시간 후, 시린지 펌프를 사용하여 젖산 링거액을 소실된 혈액량의 3배만큼 15분 동안 일정 속도로 투여하여 동물을 소생시킵니다. 동물이 소생되면 카테터를 제거하고 혈관을 결찰합니다.세 개의 봉합사를 사용하여 카테터를 근위쪽 봉합사 바로 너머까지 당긴 다음, 출혈을 방지하기 위해 이 봉합사를 완전히 묶어줍니다. 측부 혈류가 형성되어 뒷다리가 허혈 상태가 되는 것을 방지합니다. 마지막으로, 멸균된 4-0 PDSI를 사용하여 양쪽 뒷다리 절개 부위를 봉합합니다.봉합을 실시합니다. 느슨한 루프 테이프를 제거하고 동물을 깨끗한 케이지에 넣은 뒤, 수 시간 동안 순환식 가열 패드 위에 둡니다. 회복 후 단계입니다.이 도식은 출혈성 쇼크 유도 과정의 개요를 나타냅니다. 양측 캐뉼라 삽입 후 혈압계에 최초 연결을 수행하며, 5분 동안 혈압의 기저치를 측정합니다. 안정적인 혈압이 기록되면 쇼크 유도를 진행하며, 대퇴 카테터를 통해 혈액을 추출하여 혈압을 28 ± 2 mmHg로 맞춥니다. 혈액 추출은 15분의 시간 범위 내에서 이루어져야 합니다.쇼크 유도 후 2시간 30분 동안의 쇼크 기간이 이어지며, 이 기간 동안 혈압을 지속적으로 모니터링합니다. 쇼크 기간이 끝나면, 시린지 펌프를 사용하여 손실된 혈액량의 3배를 동물에게 다시 주입함으로써 제어된 소생술을 실시합니다. 마지막으로, 동물을 혈압 모니터에 다시 연결하여 또 다른 기저치 평가를 수행합니다.이 과정은 약 5분에서 10분 동안 진행됩니다. 이 그림은 출혈성 쇼크와 관련된 염증 촉진 및 항염증 반응을 나타냅니다. 염증 촉진 및 항염증 사이토카인이 대식세포, T 세포 및 수많은 다른 생리적 반응과 함께 피드백 루프 내에서 상호작용하여, 산소가 고갈된 장기를 복구하고 신체를 항상성 상태로 되돌리려는 시도인 사이토카인 폭풍이 발생합니다.이 그래픽 표현은 두 가지 출혈성 쇼크 시점에 처한 야생형 마우스의 간 기능을 위마우스(sham mice)와 비교하여 나타낸 것입니다. 그래프 A에는 알라닌 아미노전이효소(ALT) 수치가, 그래프 B에는 아스파르트산 아미노전이효소(AST) 수치가 표시되어 있습니다. 간 효소는 혈장 내 혈액 화학 분석기를 사용하여 측정되었습니다. 이 형광 현미경 이미지는 출혈성 쇼크를 겪은 야생형 마우스와 대조군 마우스의 폐 조직을 보여줍니다.actin 염색은 녹색의 점상 형태로 나타납니다. 핵 염색은 청색으로 나타납니다. iNOS 발현은 여기에서 볼 수 있듯이 적색으로 나타납니다.출혈성 쇼크가 유도된 생쥐의 경우, 폐 조직의 기관지 상피와 혈관 내피로 iNOS가 뚜렷하게 침윤된 것이 빨간색으로 나타납니다. 가짜 수술(sham procedure)을 받은 대조군 생쥐에서는 이러한 염색이 나타나지 않습니다. 이 현미경 사진들은 파라포름알데히드로 고정하고 헤마톡실린 또는 에오신으로 염색한 출혈성 쇼크 유도 생쥐 및 대조군 생쥐의 간 조직 절편을 보여줍니다.출혈성 쇼크를 유발한 생쥐의 조직 절편에서는 혈액 순환 및 산소 공급 부족으로 인한 괴사 조직이 관찰되었으나, 가짜 수술(sham procedure)을 거친 생쥐에서는 이러한 현상이 나타나지 않았습니다. 이 기술을 시도할 때는 수술 기법과 출혈 유도 과정에서 매우 인내심을 갖고 신중하게 진행하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 다발성 외상의 면역학 관련 연구 질문에 답하기 위해 이 모델을 양측 대퇴골 골절, 가성 골절 및 연조직 손상과 같은 다른 외상 모델과 결합하여 사용할 수 있음을 유의하십시오.

fixed-volume-or-fixed-pressure-a-murine-model-of-hemorrhagic-shock

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

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지주막 하 출혈의 생쥐 모델

외상 환자 중 사망의 중요한 원인 인 통제되지 않는 출혈은 쥐 모델에서 표준 간 열화를 사용하여 모델링 할 수 있습니다. 이 모델은 일관된 혈액 손실, 생존을 가져오고 지혈제를 검사 할 수있게합니다. 이 기사에서는이 중요한 모델을 수행하기위한 단계별 프로세스를 제공합니다.

실시간 혈류 역학 모니터링을 이용한 마우스의 간경화로 모델링 된 통제 할 수없는 출혈성 쇼크

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