Name: Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 학습하세요 KSHV 감염에 의해 조절된 유전자를 식별하는 이중 면역조직화학염색법을 사용하여 카포시 육종 종양 조직에서 바이러스 및 숙주 세포 단백질을 시각화하는 방법을. 이 기술은 종양 병리학 연구와 새로운 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

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우리는 그의 조언이 원고의 검토를 위해 제임스 EK 힐드레스, 메해리 의료 대학, 감사합니다. 우리는 또한 원고의 편집 다이아나 Marver 감사합니다. 에이즈 건강 불균형 연구 센터, NIH 그랜트 5U54 RR019192 - 05,, 임상 연구 메해리 센터, NIH 그랜트 P20RR011792,이 작품은 에이즈 연구 메해리 밴더빌트 센터 (NIH 그랜트 P30 AI054999 - 05)에 의해 지원되었으며 NIH에 의해 부여 P01 CA113239. DJA는 부분적으로 에이즈 연구 밴더빌트 - 메해리 센터 (CFAR) 및 임상 연구에 대한 메해리 센터 (CRC)에서 파일럿 부여에 의해 투자되었다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 보고서에 사용된 방법론은 실험 설정의 다양한 수행할 수 있습니다. 그들은 특별한 장비 또는 핵심 시설에 대한 액세스를 필요로합니다. biosaftey 수준 3 (BSL - 3) 시설의 사용을 요구할 수 있습니다 KSHV와 같은 전염성 바이러스성 병원체를 포함한 실험을 수행할 때 적절한주의가 이동해야합니다. 조직 인수도 해당 기관 검토 보드 (IRBs)에 의해 승인을 받아야합니다. 이러한 방법은 함께 체외에서 표현에 dysregulated 및 생체내뿐만 아니라 변경된 유전자 발현 프로파일의 검증 내피 세포의 유전자 전달을위한 전략에 대해 정의된 메서드를 제공합니다 유전자를 식별을위한 기반을 제공할 수 있습니다. 함께 찍은 이러한 연구 결과는 KSHV 감염에 의해 그리고 이후 구체적인 바이러스 유전자에 의해 영향을 생화 학적 경로를 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다. KSHV 같은 종양 발생 바이러스가 특정 분자 경로를...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>05-0001DJ</td><td></td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19364 (FLUKA)</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 배지</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>+ bullet kits 보충제</td></tr><tr><td>DMVEC 세포 (HMVEC)</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC2543</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Hyclone</td><td>SH30066.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>챔버 슬라이드</td><td>Nalge Nunc international</td><td>154461</td><td></td></tr><tr><td>KSHV LANA 단클론항체</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-H913</td><td>1:50 희석/IFA</td></tr><tr><td>Galectin-3 염소 다클론항체</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF1154</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti-goat FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-095-1</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti-goat Rho</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-295-003</td><td>1:100 희석/IFA</td></tr><tr><td>봉입제</td><td>Vector Laboratories</td><td>H 1500</td><td>DAPI 포함 Vectashield</td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로스</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0112</td><td></td></tr><tr><td>Donkey-anti-goat-conj.</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC 2020</td><td></td></tr><tr><td>Western 기질</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-rabbit-anti goat</td><td>Dako</td><td>305-065-045</td><td></td></tr><tr><td>AP-Strepavidin 접합체</td><td>Dako</td><td>K 0492 (키트)</td><td></td></tr><tr><td>RNase DNase Free Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>MJ Mini Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>PTC-1148C</td><td></td></tr><tr><td>바이오 광도계</td><td>Eppendorf</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>RC 6 Plus 원심분리기</td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Optima L-90K 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>MYiQ iCycler Real Time PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9770</td><td></td></tr><tr><td>TE 2000S 형광 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000S</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 200</td><td>Nikon Instruments</td><td>E 200</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75004377</td><td></td></tr></tbody></table>

kaposi의 육종 - 관련 herpesvirus (kshv)에 의해 유도된 유전자를 식별 dysregulated

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

현재 KS 남부 아프리카에서 가장 지배 HIV / AIDS 관련 강한 악의이며, 따라서 세계. 1,2은 그것이 혈관 내피 세포의 angioproliferative 종양으로 특징이며, 흉막 유출의 lymphomas의 형태로 드문 B 세포 lymphoproliferative 질병 (화소)을 생산 그리고 multicentric 캐슬맨의 질병 중 일부 형태. KS에서 세포의 3-5만이 1~5% 적극적으로 Kaposi의 육종 - 관련 herpesvirus (KSHV), KS과 관련된 etiological 에이전트 lytic 복제를 지원하는 병변, 그리고 그것은 세포 요인해야한다는 분명하다 oncogenesis 및 종양 진행의 과정에서 바이러스 요인과 상호 작용. KS 병리에 기여 6,7 식별 소설 호스트 팩터 determinants은 물론, KS의 치료를위한 소설 치료제 개발을위한 같은 종양 진행과 전이에 대한 전조 마커를 개발하기 위해 필수적입니다 dysregulated 유전자 microarray 분석에 의해 확인되면 8. 함께 비디오 내용을 우리가 KSHV 감염 후 KS 종양 조직에서 피부 microvascular 내피 세포 (DMVEC)에 변경 숙주 세포의 유전자 발현 프로그램을 식별하는 데 사용하는 방법. 9, 단백질 표현의 변화입니다 immunoblot 및 이중 레이블 immunofluorescence에 의해 확인했다. dysregulated 유전자의 transcriptional 표현의 변경은 양적 실시간 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR qRT -)에 의해 체외로 확인됩니다. 아카이브 KS 종양 조직을 이용하여 체외의 결과에 검증도 듀얼 표시 immunochemistry 및 조직 microarrays에 의해 수행됩니다. 8,10 접근은 체외에서 이후 생체내 모델 시스템의 개발을 위해 허용되는 KS 종양 조직 microenvironment에 dysregulated 유전자를 식별하기 위해 KS의 치료를위한 잠재적인 소설 치료의 발견 및 평가.

숙주 세포 요인은 설치 및 Kaposi의 육종 (KS)의 유지에 중요한 역할을한다. 우리는 KSHV에 감염된 DMVEC 전지 변경 숙주 세포 요소를 식별하는 방법을 설명하고, KS 종양 조직 인치 바이러스에 의해 변경 세포 유전자 소설 치료제에 대한 잠재적인 대상 (S) 역할을합니다.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

현재 카포시 육종(KS)은 남부 아프리카와 전 세계적으로 가장 지배적인 HIV/AIDS 관련 악성 종양입니다.1,2 이는 혈관 증식성...

이 절차의 전반적인 목적은 바이러스 및 숙주 세포 단백질에 대한 면역조직화학 염색을 통해 카포시 육종 종양 조직의 이중 표지를 입증하는 것입니다. 이는 먼저 열을 사용하여 항원을 노출함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 비오틴이 접합된 1차 항체를 적용하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 strep din 효소 접합물을 첨가하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 발색을 위해 조직에 효소 기질을 첨가하는 것입니다. 최종적으로 면역조직화학 염색을 통해 종양 조직 내의 바이러스 및 호스트 세포 단백질 모두의 국소화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 동일한 검체 내에서 감염원과 조절 장애가 일어난 세포 유전자를 동시에 식별하는 등 병리학 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 제시할 수 있습니다. 흄 후드 아래에서, 고정된 파라핀 매립 조직의 5 µm 절편이 부착된 최대 8개의 슬라이드를 자일렌이 담긴 Coplan jar에 넣습니다. 탈파라핀 처리를 하고 이중 표지 면역조직화학 염색을 준비하기 위해 10분 동안 배양합니다.조직을 100%, 95% 및 70% 에탄올 용액의 단계별 농도 시리즈에 각각 5분 동안 담가 재수화합니다. 항원 마스킹 해제(항원 회복이라고도 함) 전, 슬라이드를 증류수에 최소 10분 동안 옮겨둡니다. 항원 마스킹 해제를 위해, 95 °C로 갓 준비된 용액이 담긴 플라스틱 용기에 슬라이드를 잠기게 합니다.50 millimolar 시트르산 완충액을 전자레인지로 가열하여 95 °C에서 15분 동안 끓는 상태를 유지합니다. 슬라이드를 즉시 실온의 증류수가 담긴 코플래너(coplanar)로 옮깁니다. 슬라이드를 새로 조제한 퀀칭 용액(quenching solution)이 채워진 깨끗한 코플랜 용기로 옮깁니다.내인성 peroxidase를 억제하기 위해 상온에서 30분 동안 반응시켰습니다. 상온의 1x PBS에서 5분씩 3회 세척합니다. PBS 세척액에서 슬라이드를 꺼내어 여분의 액체를 털어낸 후, 조직 위에 200 µL의 얼음처럼 차가운 블로킹 용액을 넣고 건조를 방지하기 위해 파라핀 스트립으로 덮어줍니다.슬라이드를 습윤 챔버에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 파라핀 스트립을 제거하고 슬라이드에서 과량의 블로킹 용액을 털어낸 후, 블로킹 버퍼에 희석한 얼음처럼 차가운 KSHV Lana 항-1차 항체 50~100 µL를 조직 전체에 도포합니다. 새 파라핀 스트립으로 조직을 덮고 습윤 챔버에서 1~2시간 동안 배양합니다.슬라이드를 1X PBS로 5분 동안 세 번 세척합니다. 각 세척 단계 후, 1X PBS에 희석한 biotinylated secondary antibody를 50~100 µL씩 첨가하고 습윤 챔버 내 실온에서 30~45분 동안 배양합니다. 슬라이드가 배양되는 동안 peroxidase conjugated streptavidin을 준비합니다.daco animation duet kit를 사용하여, 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 1 X PBS 1 mL와 용액 A 10 µL를 넣고 볼텍싱하여 혼합합니다. 용액 B 10 µL를 추가하고 다시 볼텍싱한 후, 실온에서 30분 동안 배양합니다. 슬라이드를 1 X PBS로 3회 세척하며, 세척 당 5분씩 수행합니다.이전과 마찬가지로, 슬라이드에 100~200 µL의 horse radish peroxidase 접합 streptavidin을 첨가합니다. 습윤 챔버 내의 상온에서 30~45분 동안 배양합니다. 다시 한번, 1X PBS로 슬라이드를 3회 세척하며, 세척당 5분씩 진행합니다.세척 종료 5분 전에 20 mL의 1X PBS와 25 µL의 3% Hydrogen peroxide가 들어 있는 50 mL 코니컬 튜브에 DAB 정제 1정을 넣습니다. 슬라이드를 하나씩 작업하며 0.45 µm 시린지 필터로 DAB 용액을 여과합니다. 광학 현미경의 명시야 조명 하에서 조직에 DAB 용액 1 mL를 도포합니다.감염된 세포에서 KSHV Lana의 색 발현을 모니터링하여 원하는 색 발현 정도에 도달하면, 슬라이드를 증류수에 5분 동안 담가 이중 표지를 위한 반응을 중단시킵니다. 동봉된 텍스트에 기술된 대로 95 °C의 시트르산 완충액(citrate buffer)에서 항원 마스킹 해제를 다시 수행한 후 염색합니다.동일한 절차를 사용하여, per mount 마운팅 용액으로 조직을 마운팅하고 커버 슬립으로 덮은 후 명시야 조명 하에서 이미지를 촬영합니다. 통계적 분석을 위해 파라핀 블록에 매립된 많은 개별 검체를 펀칭하여 조직 마이크로어레이로 배열하여 보내는 것이 일반적입니다. 회색 화살표로 표시된 세포 단백질 pcam one CD 31에 양성 반응을 보이는 갈색 세포들이 혈관 주위에 밀집해 있습니다.바이러스 단백질 양성 반응을 보이는 적혈구입니다. 검은색 화살표로 표시된 라나(Lana)는 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 감염된 세포를 나타냅니다. 여기는 세포 단백질 pcam 양성 반응을 보이는 갈색 세포들의 저배율 확대 이미지입니다.혈관 주변 영역에서 회색 화살표로 표시된 CD 31 하나가 관찰된다. 빨간색 세포는 바이러스 단백질 양성이다. 검은색 화살표로 표시된 Lana는 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(kaposi's sarcoma associated herpes virus)에 감염된 세포를 나타낸다.여기 바이러스 단백질에 대해 양성을 보이는 갈색 세포들이 나타난 종양 조직 마이크로어레이 상의 KS 종양 조직 생검 샘플이 있습니다. Lana는 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 감염된 세포들을 나타내며, 일부 방추세포 형성이 관찰됩니다. 여기 바이러스 단백질에 대해 양성을 보이는 갈색 세포들이 나타난 종양 조직 마이크로어레이 상의 또 다른 KS 종양 조직 생검 샘플이 있습니다.Lana는 방추세포 형성이 많이 나타나는 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 감염 세포를 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 포르말린 고정 파라핀 임베딩 조직에 대해 이중 표지 면역조직화학 염색을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 실험을 수행할 때 현미경으로 발색 과정을 주의 깊게 관찰하고 물로 반응을 중단시키는 것이 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

인간 게놈의 8 %를 차지 인간 내인성 레트로 바이러스 (HERV)는, 부족한 코딩 능력 만 십만 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸) 유지. 사용자 지정 Affymetrix의 마이크로 어레이는 개별 HERV의 궤적 표현을 식별하도록 설계되었으며, 향후 임상 연구에 대한 개념의 증거로 전립선 암 조직에 사용되었다.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

우리는 인간 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)와 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 밀접하게 관련되는 모델 헤르페스 바이러스, 뮤린 감마 허피스 바이러스 68 (γ HV68)로 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인 생성을 측정하기 위해 프로토콜을 설명한다. 유전자 변형 마우스 종자와 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)를 활용하여, 우리는 항 바이러스 사이토 카인 생산 생체 내 및 생체 모두를 평가. 렌티 바이러스 전달하여 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 구성 요소의 표현을 "재구성", 우리는 더 특정 선천성 면역 분자를 정확하게 지적하고 차등 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 조절하는 중요한 신호 이벤트를 해부하다.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

바이러스 성 transcriptional 팩터리는 세포질 RNA 중 합 효소 II 다시 활성화 하는 동안 바이러스 성 유전자 전사를 증가 함께 풍성 하 게 이산 구조. 여기, 적극적으로 면역 형광 얼룩이 지 고 제자리에서 RNA 교 잡의 조합에 의해 3D 핵 공간에서 바이러스 성 염색 질을 속기의 사이트를 찾을 하는 방법을 설명 합니다.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

우리는 현탁액 또는 부착물에서 서정적으로 감염된 인간 세포 내의 다중 헤르페스 바이러스 RNA를 시각화하기 위해 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뉴클레오세포질을 생성하는 형광의 정량화를 포함하고 면역형광(IF)을 가진 숙주 및 바이러스 성 단백질의 동시 시각화를 위해 확장될 수 있다.

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

이 프로토콜은 BAC16 유래 비리온을 사용하여 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스의 새로운 용해 감염을 모델링하는 시험관 내 시스템을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 초기 바이러스 복제 및 전파를 조사할 수 있습니다. 감염성 바이러스 생산은 GFP 기반 감염 단위 분석 및 캡슐화된 바이러스 게놈의 실시간 PCR에 의해 정량화됩니다.

무세포 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 의한 새로운 용해 감염의 확립 및 정량화

학습하세요 KSHV 감염에 의해 조절된 유전자를 식별하는 이중 면역조직화학염색법을 사용하여 카포시 육종 종양 조직에서 바이러스 및 숙주 세포 단백질을 시각화하는 방법을. 이 기술은 종양 병리학 연구와 새로운 치료 표적 발굴에 활용됩니다.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

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