로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

제 이름은 Gail Siebel이며, 국립 알코올 남용 및 알코올 중독 연구소(NIAAA)의 Veronica Alvarez 박사 연구실에서 박사후 연구원으로 재직 중입니다. 본 연구는 Oregon Primate Center의 Kathleen Grant 박사 및 Andrew Wow, 그리고 본 연구에 사용된 비인간 영장류 조직을 제공해 주신 Wake Forest University의 James Dene 박사와의 협력을 통해 수행되었습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 뉴런에 형광 염료를 도입하여 설치류 및 영장류 등 다양한 종의 모든 연령대 뇌 절편을 표지하는 것입니다.

수상돌기 및 수상돌기 가시의 형태학적 연구를 위해, 먼저 Ts와 비드를 D eye와 같은 친지성 염료로 코팅합니다. 절차의 두 번째 단계는 튜빙 내부를 D eye 코팅 비드로 채운 후, 이를 Helios 유전자 총 시스템의 탄환으로 사용할 수 있도록 작은 조각으로 자르는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 유전자 총을 사용하여 뇌 절편에 D eye 코팅 비드를 주입하는 것입니다.

절차의 마지막 단계는 선택 사항이며, 다른 마커를 동시에 국소화하기 위해 stylistics를 면역 염색과 결합할 수 있습니다. 결과적으로 공초점 또는 이광자 현미경과 같은 고해상도 이미징과 수상돌기 분지 및 수상돌기 가시 형태 연구에 적합한, 신경세포의 희소한 형광 표지를 확인할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 모든 종, 연령 및 유전자형의 동물 뇌 절편에 stylistics를 적용할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 면역 염색과 병행하여 사용할 수 있으며, 고해상도 현미경 관찰에 적합한 희소한 형광 표지를 생성합니다. 비드를 제작하기 전, 화학 흄 후드에서 450 milliliters의 염화메틸렌에 13.5 milligrams의 지질친화성 염료를 넣어 최종 농도가 30 milligrams per milliliter가 되도록 텅스텐 비드를 코팅합니다. 300 milligrams의 텅스텐 비드가 들어 있는 Eloqua 튜브 하나를 준비하고 300 microliters의 염화메틸렌을 추가한 후, 비드를 재현탁하여 균질한 용액을 만들기 위해 강하게 파이펫팅합니다.

불렛 세트당 100 milligrams의 텅스텐 비즈만을 사용하며, 비즈가 계속 부유 상태를 유지하도록 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 비즈 100 milliliters와 용해된 염료를 유리 슬라이드 위에 올리고 충분히 혼합합니다. 피펫 팁을 사용하여 비즈가 연한 회색으로 변할 때까지 완전히 자연 건조합니다. 슬라이드 아래에 깨끗한 왁스 처리된 백지를 놓고, 깨끗한 면도날을 사용하여 각 색상의 불렛에 해당하는 비즈를 유리 슬라이드에서 긁어내어 고운 가루 형태로 분쇄합니다.

코팅된 비드들을 웨이 페이퍼(whey paper) 위로 긁어낸 후, 15 milliliter 원추형 튜브에 깔때기를 이용해 넣습니다. 3 milliliter의 물을 추가하고, 뭉친 부분을 완전히 분해하기 위해 상온의 워터 배스에서 10 내지 30분 동안 초음파 처리합니다. 한쪽 끝을 사선으로 자른 0.7 meter 길이의 청록색 튜브를 준비하고, 반대쪽 끝을 튜브 어댑터를 사용하여 12 milliliter 주사기에 연결합니다. 튜브의 자유단(free end)을 10 milligram per milliliter의 polyvinyl perone 또는 PVP 용액 10 milliliter가 담긴 튜브에 넣고, 용액이 튜브를 통과하여 주사기 내부로 완전히 들어오도록 흡입합니다.

비드 용액을 보텍싱하는 동시에 시린지로 펌핑하여 균일한 혼합물을 만들고, 비드가 침전되지 않도록 신속하게 용액을 튜브 안으로 완전히 흡입합니다. 양끝에서 튜브를 팽팽하게 유지하면서 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오. 공기 방울이 있으면 해당 부위에 비드가 부착되지 않습니다. 튜브를 좌우로 기울여 고르게 도포하십시오.

비드를 분산시킵니다. 튜브를 prep station에 삽입하고 비드가 가라앉을 때까지 30~60초 동안 기다립니다. 시린지를 사용하여 천천히 그리고 부드럽게 조작하십시오.

비즈만 남기고 물을 제거합니다. 즉시 시린지를 분리하고 튜빙을 회전시키기 시작합니다. 물방울이 더 이상 보이지 않을 때까지 10~20분 동안 프렙 스테이션의 질소 유량을 4~5 LPM(건조 상태)으로 조절합니다.

프렙 스테이션에서 튜빙을 제거하고, 튜빙 커터를 사용하여 불렛을 13 millimeter 길이로 자릅니다. 상태가 좋은 불렛은 내부가 옅은 회색 안개처럼 균일하게 코팅되어 있습니다. 무수 황산 칼슘과 같은 건조제가 들어 있고 알루미늄 호일로 감싼 신틸레이션 바이알에 불렛을 넣습니다. 발사 준비가 될 때까지 상온에서 보관하십시오.

Diic 라벨링은 다양한 종과 연령의 뇌 조직 내 뉴런을 염색하는 데 사용할 수 있으며, 다양한 방법으로 보존된 조직에 적용 가능합니다. 절편 전 또는 후로 고정된 뇌 절편을 24-웰 플레이트의 웰에 넣으십시오.

슬라이스를 1X PBS로 5~10분씩 3회 세척합니다. PBS를 피펫으로 제거하고 붓을 사용하여 슬라이스를 웰 중앙에 맞춥니다. 진 건(gene gun) 배럴 라이너 끝의 두 금속 확산 스크린 사이에 3.0 µm 필터 조각을 배치합니다.

배럴 라이너의 끝부분이 시료에서 1.5 centimeters 떨어지도록 유전자 총을 잡습니다. 120 to 180 PSI 헬륨 가스 압력으로 비즈를 절편에 쏩니다. 과잉 염료를 제거하기 위해 1X PBS로 절편을 빠르게 세 번 헹굽니다.

모든 액체 처리 단계 동안 슬라이스의 절단면이 위를 향하도록 하십시오. DAI가 수지상 돌기를 따라 퍼질 수 있도록 슬라이스를 PBS에 3~6시간 동안 보관하고 호일로 덮어줍니다. DAI는 빛에 민감하므로 이 단계에서 슬라이스를 마운팅하거나, 다음 섹션에 상세히 설명된 대로 항체 추가 염색을 진행할 수 있습니다. 염색을 진행하려면 0.01% TRITTON X 100이 포함된 투과 용액 300~500 µL를 각 슬라이스에 가하고, 실온에서 정확히 15분 동안 배양합니다.

웰에서 투과액을 제거하고, 10% goat serum과 0.01% tritan X 100이 포함된 1X PBS 블로킹 용액으로 절편을 블로킹한 후 실온에서 30분 동안 배양합니다. 각 웰에 블로킹 용액으로 희석한 1차 항체를 300~500 µL 첨가하고, 항체에 따라 실온에서 1~2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 1X PBS로 절편을 3회 세척하며, 매 세척 시 5~15분간 수행한 후 웰에서 용액을 제거합니다.

블로킹 용액에 희석한 2차 항체 300 내지 500 µL를 각각 추가합니다. 이전과 동일하게 1×PBS로 각 5 내지 15분씩 4회 세척하고, 형광 마운팅 매질을 사용하여 절편을 유리 슬라이드 위에 마운팅한 후 18 by 18 mm 커버슬립으로 덮습니다. 투명 매니큐어로 가장자리를 밀봉하기 전, 상온에서 6 내지 12시간 동안 건조시킨 후 4 °C에서 암소 보관하거나 덮어 둡니다.

라벨링된 뇌 절편의 대표적인 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 확인해야 할 두 가지 중요한 특징은 저배율에서의 희소한 라벨링 패턴과 개별 세포 구성 성분을 식별할 수 있는 능력입니다. 불렛(bullet)의 준비가 잘못되었거나 조직이 과고정된 경우, 여기에 표시된 것처럼 라벨링 상태가 불량해질 수 있습니다.

문제 해결 팁이 여기에 제공됩니다. 마우스 뇌에서 유래한 TAL 배지 내의 회전 뉴런과 그 복잡한 수지상 돌기 분지 패턴의 공초점 이미지입니다. 공초점 현미경을 사용할 때 얻어지는 광학적 절편화(optical sectioning)를 통해 조직 절편 내의 단일 표지 세포를 분리할 수 있습니다.

고배율 이미지는 설치류 뇌와 비인간 영장류 뇌의 가지돌기 분절을 보여줍니다. ICS를 면역 염색과 결합했을 때, 이 기술로 구현된 높은 형광 염색 강도 덕분에 가지돌기 가시가 뚜렷하게 나타남에 주목하십시오. 이 이미지는 적색의 D eye 표지와 녹색의 GFP 발현 면역 염색이 공국소화된 예를 보여줍니다.

이 이미지는 D1 도파민 수용체 프로모터 하에서 형광 단백질 GFP를 발현하는 형질전환 생쥐의 뇌 절편에 해당합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 펠릿을 준비하고 제닝 건(Jening gun)을 사용하여 형광 염료로 뉴런을 희박하게 라벨링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 통해 뉴런의 형태를 명확하게 시각화하고 가지돌기 분지 및 가시를 연구할 수 있습니다.