로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

우리는 설치류와 다양한 연령대의 비 인간 영장류의 뇌 조각의 뉴런에 같은 DiI 같은 형광 염료를, 소개하는 유전자 총을의 사용을 보여줍니다. 이 특정한 경우에, 우리는 성인 생쥐 (3-6개월 세) 및 성인 cynomologus 원숭이 (9-15년 이전)를 사용합니다. 원래 박사 Lichtman의 실험실에 의해 설명이 기술은 (간

제 이름은 게일 시벨(Gail Siebel)이고, 국립 알코올 남용 및 알코올 중독 연구소(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism)의 베로니카 알바레즈(Veronica Alvarez) 박사 실험실에서 박사 후 연구원으로 재직 중입니다. 이 연구는 오리건 영장류 센터의 캐슬린 그랜트(Kathleen Grant) 박사와 앤드류 와우(Andrew Wow) 박사, 웨이크 포레스트 대학(Wake Forest University)의 제임스 딘(James Dene) 박사와 공동으로 수행되었으며, 이 연구에 사용된 비인간 영장류 조직을 제공했습니다. 이 절차의 정밀 검사 목표는 뉴런에 형광 염료를 도입하고 모든 연령대의 설치류 및 영장류와 같은 다른 종의 뇌 단면을 표시하는 것입니다.

수상돌기와 수지상 가시의 형태를 연구하기 위한 목적으로, 이것은 먼저 Ts와 비드를 D eye와 같은 친유성 염료로 코팅하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 튜브에 D 아이 코팅된 비드를 라이닝하고 Helios 유전자 총 시스템의 총알 역할을 하는 작은 조각으로 자르는 것입니다. 절차의 세 번째 단계는 유전자 총을 사용하여 D 눈으로 코팅된 구슬을 뇌 절편에 쏘는 것입니다.

절차의 마지막 단계는 스타일리스틱스를 면역 염색과 결합하여 다른 마커의 위치를 동시에 파악할 수 있기 때문에 선택 사항입니다. 궁극적으로, 컨포칼 또는 이광자 현미경 검사와 같은 고해상도 이미징에 적합한 뉴런의 희박한 형광 표지와 수지상 분지 및 수지상 척추 형태 연구를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 모든 종, 연령 및 유전자형의 동물의 뇌 절편에 스타일을 적용할 수 있다는 것입니다.

면역 염색과 함께 사용할 수 있으며 총알을 만들기 전에 고해상도 현미경 검사에 적합한 희박한 형광 표지를 생성합니다. 450 밀리리터의 메틸렌 클로라이드에서 13.5 밀리그램의 친유성 염료 염료 아이에 화학 흄 후드의 친유성 염료로 텅스텐 비드를 코팅하여 밀리리터당 30 밀리그램의 최종 농도를 얻습니다. 300 밀리그램의 텅스텐 비드가 들어있는 프리 Eloqua 튜브 하나를 가져 와서 300 마이크로 리터의 메틸렌 클로라이드 파이프를 강력하게 첨가하여 비드를 재현 탁탁하고 균질 한 용액을 만듭니다.

총알 세트당 100mg의 텅스텐 비드만 사용되며, 비드를 위아래로 피펫팅하여 비드를 재현탁 상태로 유지하고, 100ml의 비드와 용해된 다이 아이를 유리 슬라이드에 첨가하고 완전히 혼합합니다. 피펫 팁을 사용하여 비드가 연한 회색으로 변할 때까지 공기 중에서 완전히 건조시킵니다. 깨끗한 레이서 블레이드를 사용하여 슬라이드 아래에 왁스 칠한 깨끗한 흰 조각을 놓습니다 총알의 각 색상에 대해 유리에서 구슬을 긁어내고 밀어 고운 가루로 D로 깍둑썰기합니다.

코팅된 구슬을 유청 종이에 긁어내고 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 물 3ml를 넣고 실온에서 10-30분 동안 수조에서 초음파 처리하여 덩어리를 완전히 제거합니다. 한쪽 끝이 비스듬히 0.7미터의 청록색 튜브를 자르고 튜브 어댑터를 사용하여 다른 쪽 끝을 12ml 주사기에 연결하고, 자유 끝을 10밀리리터당 10밀리리터 폴리비닐 페론 또는 PVP 용액이 들어 있는 튜브에 넣고 용액을 튜브를 통해 주사기로 완전히 끌어옵니다.

구슬의 강수를 피하기 위하여 빨리 작동하는 균질한 혼합물을 만들기 위하여 주사기로 양수하는 동안 구슬 해결책을 소용돌이치고십시오, 배관으로 해결책을 완전하게 당깁니다. 튜브의 양쪽 끝을 팽팽하게 유지하면서 비드가 해당 지점의 튜브에 부착되는 것을 방지하는 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 좌우로 균일하게 기울이십시오.

구슬을 분배합니다. 튜브를 준비 스테이션에 공급하고 비드가 30-60초 동안 가라앉을 때까지 기다립니다. 주사기를 사용하여 천천히 그러나 부드럽게 사용하십시오.

구슬을 남기고 물을 제거하십시오. 즉시 주사기를 분리하고 튜브를 회전시키기 시작합니다. 준비 스테이션의 질소 흐름을 4-5LPM으로 조정하고 물방울이 더 이상 보이지 않을 때까지 10-20분 동안 건조합니다.

준비 스테이션에서 튜브를 제거하고 관찰 된 튜브 커터로 총알을 13mm 길이로 자르고 좋은 총알에는 내부를 균일하게 코팅하는 희미한 회색 안개가 생깁니다. 무수 황산칼슘과 같은 건조제가 들어 있는 호일로 포장된 섬광 바이알에 총알을 넣습니다. 촬영할 준비가 될 때까지 실온에 보관하십시오.

Diic Labeling은 다양한 종과 연령의 뇌 조직에 있는 뉴런을 염색하는 데 사용할 수 있으며 다양한 방법을 사용하여 보존할 수 있습니다. 자르기 전이나 후에 고정된 뇌 조각을 24의 우물에 넣습니다. 웰 플레이트.

XPB S3를 한 번 씻을 때마다 5-10분 동안 슬라이스를 씻습니다. PBS에서 피펫을 떼어내고 페인트 브러시를 사용하여 슬라이스를 우물의 중앙에 놓습니다. 유전자 건의 배럴 라이너 끝에 있는 두 개의 금속 확산 스크린 사이에 3.0 마이크로미터 필터 조각을 놓습니다.

배럴 라이너의 끝이 샘플에서 1.5cm 떨어지도록 유전자 총을 잡습니다. 120-180 PSI 헬륨 가스 압력으로 슬라이스에 비드를 쏘십시오. 여분의 염료를 제거하기 위해 하나의 XPBS로 슬라이스를 빠르게 세 번 헹굽니다.

모든 액체 취급 단계에서 슬라이스의 샷 표면이 위를 향하도록 하십시오. 슬라이스를 PBS에 3-6시간 동안 보관하여 DAI가 호일로 덮인 수상돌기 덮개를 따라 퍼질 수 있도록 합니다. dai는 빛에 민감하기 때문에 이 단계에서 slice를 장착하거나 다음 섹션에 설명된 대로 항체로 추가 staining을 수행하여 각 slice에 대해 하나의 XPBS에 0.01%TRITTON X 100을 함유한 300-500μl의 투과 용액에서 staining을 진행하고 실온에서 정확히 15분 동안 배양합니다.

웰에서 투과 용액을 제거하고 10% 염소 혈청과 0.01% Tritan X 100이 포함된 용액의 슬라이스를 XPBS 1회에 담아 실온에서 30분 동안 배양합니다. 차단 용액에 희석된 1차 항체 300-500마이크로리터를 각각에 첨가합니다. 우물은 항체에 따라서 1개에서 2시간 동안 실온에 또는 밤새도록 배양하고, 각 세척 5 15 분 동안 1개의 XPBS를 가진 3 번 세척 조각, 우물에서 해결책을 제거하십시오.

차단 용액에 희석된 2차 항체 300-500 마이크로리터를 각각에 첨가합니다. 이전과 같이 5-15분 동안 하나의 XPBS로 4번 세탁한 다음 형광 장착 매체가 있는 유리 슬라이드에 슬라이스를 장착하고 18 x 18mm로 덮습니다. 커버 슬립은 실온에서 6-12시간 동안 건조시킨 후 투명한 매니큐어로 가장자리를 밀봉하고 어두운 곳에 보관하거나 섭씨 4도에서 덮습니다.

라벨링된 뇌 단면의 예시적인 이미지가 여기에 나와 있습니다. 찾아야 할 두 가지 중요한 특성은 저배율에서 희박한 라벨링 패턴과 개별 세포 구성 요소를 식별할 수 있는 능력입니다. 총알을 잘못 준비하거나 조직을 과도하게 고정하면 여기에 표시된 것처럼 잘못된 라벨링이 발생할 수 있습니다.

문제 해결 팁은 여기 텍스트에 제공됩니다. 쥐의 뇌에서 TAL 매체 회전 뉴런과 수지상 분기의 복잡한 패턴에 대한 컨포칼 이미지가 있습니다. 컨포칼 현미경을 사용할 때 달성되는 광학 절편은 조직 섹션에서 단일 표지된 세포를 격리할 수 있습니다.

고배율 이미지는 설치류 뇌와 인간이 아닌 영장류 뇌의 수상돌기 분절을 보여줍니다. 이 기법으로 달성된 높은 강도의 형광 염색으로 인해 ICS와 면역 염색을 결합할 때 잘 정의된 수지상 가시가 생성됩니다. 이 이미지는 녹색의 GFP 발현을 위한 면역 염색과 함께 빨간색의 D eye 표지의 공동 국소화의 예를 보여줍니다.

이 이미지는 D one 도파민 수용체 프로모터 하에서 형광 단백질 GFP를 발현하는 형질전환 마우스의 염 절편에 해당합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 총알을 준비하는 방법과 형광 염료로 희박한 뉴런에 Jing gun을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 사용하면 신경 세포 형태학을 명확하게 시각화하고 디트 분기 및 척추를 연구할 수 있습니다.