Name: 이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 56 s
Description: 배우세요 이중-공진 코히어런트 반스톡스 래맨 산란(DR-CARS)을 이용한 생물학적 구조의 차등 영상법입니다. 세 개의 동기화된 단파장 레이저를 사용하여 약한 래만 신호의 감도를 높이고 세포의 화학적 특이 이미징을 제공하는 방법을 익히세요.

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우리는 DR - 자동차 기술을 개발하고 그들의 공헌에 대한 이완 Schie과 세바스찬 Wachsmann - Hogiu 감사하고 싶습니다. 타일​​러 윅스 로렌스 리버 모어 국립 연구소의 로렌스 학술 프로그램에 의해 지원을 인정한다. 토마스 허저는 보조금 프로그램을 통해 미국 심장 협회의 지원에 감사합니다. 이 작품 또한 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 기금에 의해 일부 지원되었다. Biophotonics, NSF 과학 기술 센터를위한 센터는 공동 계약 번호 PHY 0,120,999 아래 캘리포니아 데이비스 대학에 의해 운영됩니다. 지원도 연구 자원 (NCRR)에 대한 국립 센터에서 부여 번호 UL1 RR024146 아래 UCD 임상 Translational 과학 센터에서 인정받고 있습니다.

1. 자동차와 DR - 자동차 신호의 생성 자동차를 생성하고 DR - 자동차 신호는 동시에 세 조정할 수 및 동기 펄스 레이저 짧은 소스가 필요합니다 순서를 유지해야합니다. <ol><li> 우리가 한 10 W 레이저 (PicoTrain, HighQ 레이저, 주식 회사)로 시작하는 세 동기 펄스를 얻을 수 있습니다. 이 레이저는 1064 nm의 파장의 고정 7 PS의 고정 펄스 길이, 76 MHz의의 고정 반복 속도를했습니다. </li><li> 하프 웨이브 접시 일련의 사용 및 빔 스플리터를 편광하면 광선이 세 부분으로 나뉩니다 큐브. 편광 빔 스플리터 큐브와 함께 반 파장 판은 우리의 방향을 변경하지 않고 빔의 각 구성 요소의 전원의 양을 조절할 수 있습니다. 일반적으로, 두 광선은 ~ 4.5 W 각각 조정하고, 세 번째 빔이 남아있는 한 W.를 포함 아르 </li><li> 두 높은 전력 광선은 다음 두 개의 독립적인 광 파라메 트릭 발진기 (OPO의, 아반떼, 원숭이 GmbH를, 베를린, 독일)로 이동합니다. 다른 파장 두 개의 낮은 에너지 광자로 높은 에너지 광자를 변환하는 OPO의 사용 차이 주파수 생성. 이 효과를 달성하는 데 사용되는 크리스탈의 온도를 조절함으로써, 결과 광자의 파장은 0.1 nm의 시간을 제어할 수 있습니다. 으로 주파수 더블링이 신호를 1,064 NM의 고정 파장을 가진 레이저 지금 910 nm의에 780 nm의 사이 어디서나 조정할 수 있습니다 레이저 빔을로 변환하실 수 있습니다. 같은 1064 NM 원본과 두 개의 OPO의 펌핑함으로써, 우리는 자동으로 오리지널 펌프 레이저로 동기화 두 독립적으로 조정할 수있는 레이저 소스를 얻습니다. </li><li> 1,064 NM 펌프 레이저에서 세 번째 (최저 전력) 빔이 세 기둥이 (2 펌프 레이저에서 OPOs, 1) 나중에 recombined 수 있도록 이색성 거울의 조합에 의해 OPO의 주위에 이동합니다. 효율적으로 일관된 래맨 신호 광자를 생산하기 위해 recombined 펄스는 두 temporally과 공간 overlapped해야합니다. OPO의 각 레이저 펄스는 결정을 여러 번 통과하므로 링 충치를 포함하기 때문에, OPO의 여행을 통해 원래 펌프 빔에 비해 상당한 지연에 발생하는 여분의 거리를 보낸 빔. 이 거리는 그들이 이색성 거울을 사용 recombined 전에이 광선은 다른 두 사람과 같은 거리를 여행하도록 별도의 거울을 도입하여 세 번째 빔을 보상해야합니다. </li><li> 멋진 각각의 빔이 프리즘 retroreflectors를 사용하여 조정 지연 단계를 여행 경로의 길이 조정, 각각의 빔 경로로 소개를 제공하기 위해. </li><li> 하프 웨이브 플레이트 및 편광 빔 스플리터 조각의 또 다른 집합은 우리가 독립적으로 OPO의 입력에 영향을 미치지 않고 각 광선의 전원을 조정할 수 있도록 각 광선에 추가됩니다. </li><li> 이색성 거울 먼저 두 OPO의 다음 1064 NM 빔을에서 빔을 결합하는 데 사용됩니다. 케어는 대들보는 정확하게 (그들은 collinear 아르 IE와 유사한 발산을 가지고) overlapped되는 것을 보장하기 위해 이동해야합니다. 이 (~ 1m) 이색성 거울에서 가까운 빔 중복 (몇 cm 이내)와 지금까지를 비교하여 확인하실 수 있습니다. </li><li> 펄스 레이저를 사용하는 이점은 여전히​​ 낮은 평균 강도를 유지하면서 각각의 펄스는 일관된 래맨 신호의 효율적인 세대 수 있도록 샘플에서 하이 피크 에너지를 수있다는 것입니다. 높은 평균 강도는 샘플을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 추가로 최대 에너지를 희생하지 않고 평균 강도를 조절하기 위해 세 가지 결합 대들보는 우리 그 펄스의 반복 속도를 조절할 수있는 펄스 따는 등 전자 광학 변조기 (Pockel의 휴대폰, ConOptics) 기능을 통해 발송됩니다 샘플에 도착하므로 평균 강도. </li><li> 통합 레이저 광선은 다음 높은 NA의 목적으로 거꾸로 현미경으로 결합하고 있습니다. 목표는 일반적으로 우리 OPO의 tunability과 1,064 nm의 광선의 범위에 걸쳐 색수차에 대한 수정되었습니다 1.2의 수치 구경 (NA)와 60 X 물 객관적인 렌즈입니다. 높은 NA의 객관적인 렌즈에 의해 생성된 초점 꽉는 마이크론 규모의 일관된 래맨 신호의 가장 효율적인 세대 수 있습니다. </li><li> 통합 빔은 현미경 목표의 뒷면 포트를 너무 많이 넣다하기 위해 확장됩니다. 현미경 목표의 뒷면을 overfilling함으로써 우리는 최고의 초점 조건을 얻을 수 있으므로 우리의 현미경 시스템에서 최고의 공간 해상도. </li><li> 우리가 현미경의 목적 렌즈는 우리를 상업 빔 - 스캔 공촛점 현미경과 유사한 예제를 통해 빔을 래스터는 - 스캔하여 이미지를 얻을 수 있습니다 XYZ 압전 무대에 장착할 수 있습니다. </li></ol> 2. 쓰리 쇼트 펄스 레이저의 사용 다양한 C에서 여러 차량 신호의 생산 세 짧은 펄스 레이저 결과의 사용이 레이저뿐만 아니라 3 색 자동차와 세 레이저의 조합에서 DR - FWM 신호 ombinations. <ol><li> 신호의 파장은 서로 가까운 spectrally 거짓말을하실 수 있습니다. 신호가 가까이 함께하는 경우는 고정 파장 대역 통과 필터 및 이색성 거울을 사용하여 분석을 위해 그들을 구분하기 어려울 수 있습니다. 이러한 이유로 우리의 신호는 공간 다른 파장의 신호를 분리하는 효율적인 단색 역할을 영상 분석기 (SpectraPro 2300i, 액튼 연구)에 전달됩니다. </li><li> 인하 위치에 분광계 내의 전자 actuated 플립 미러는 전체 신호 범위에 걸쳐 spectroscopic 정보를 제공하는 백업 조명 깊은 고갈 전하 결합 소자 (CCD) 카메라로 신호를 보내고 우리가 다양한 일관성을 파악하고 최적화할 수 있습니다 래맨 신호. </li><li> 우리가 이미지를 원하는되는 신호를 선택하려면 우리는 간단하게 변경 후 공급 업체 - 공급 제어 및 센터에 데이터 수집 소프트웨어 (WinSpec, 프린스턴 인 스트 루먼트), CCD 카메라에 대한 관심의 절정을 사용하여 분광계 내의 격자를 회전하고 단일 광자 계수의 눈사태 사진 다이오드 (APD)가 첨부되었습니다하기 위해 두 번째 출구 포트로이 신호를 리디렉션하는 플립 미러의 위치. </li><li> 목표 렌즈 다음 래스터 스캔되고 APD에 기록된 신호는 데이터 수집 소프트웨어 (SymPhoTime, Picoquant GmbH를, 베를린, 독일)를 통해 각 픽셀에 대한 계산 속도 광자를 표시하여 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. </li><li> 우리는 우리 후처리 동안 신호를 비교할 수 있습니다 각각의 원하는 일관된 래맨 신호에 대해이 이미징 절차를 반복합니다. </li></ol> 3. 샘플 준비 명확하고 재현성 이미지를 얻기 위해서는 몇 가지주의 샘플 준비에 촬영해야합니다. <ol><li> 샘플은 일반적으로 ~ 150 마이크론 두께의 유리 coverslips에 준비가되어 있습니다. 이러한 coverslips 일반적으로 사용되는 1.2 NA의 목표와 고해상도 이미징을위한 충분한 얇은 있습니다. </li><li> 레이저 빛이 작은 투명 개체를 통해 diffracted 때 유전체 개체의 광학 트래핑가 발생할 수 있습니다. 밀접하게 초점을 맞추고, 하이 피크 전력의 사용은 짧은 펄스 레이저 광선 다음 흐리게하거나 발랐습 이미지 결과 따라 작은 세포 또는 세균을 끌 수 있습니다. 이것을 방지하기 위해서는 첫번째 스핀 코팅에 의해 폴리 - L - 라이신의 얇은 레이어를 적용하여 유리 coverslip의 표면에 시료를 고정 할 수 있습니다. </li><li> 문화 전지 유리 바닥 문화 요리들은 세포 배양 성장 요리에서 세포를 분리하지 않고 이미지에 대해 허용되는 이용하실 수 있습니다. </li><li> 이 공헌 실험을 위해 우리는 먼저 포름 알데히드 - 고정 C. 입금 유리 커버 슬립에 엘레간스의 선충류 벌레. </li><li> 다음 웜 5 M 진정제를 맞았을 포도당 용액 20 μL 비말을 추가합니다. 진정제를 맞았을 포도당 솔루션은 독특하고 강력한 래맨 배경 서명을 제공합니다. </li></ol> 4. 샘플 분석 제대로 이중 - 공진 향상 효과를 활용하기 위해서는 두 래맨 - 공진 물질의 래맨 스펙트럼을 알 수 있어야합니다. <ol><li> 일단 샘플은 관련 자발적인 래맨 스펙트럼을 구하고 적절한 봉우리를 식별할 수 공촛점 래맨 현미경을 사용하여 그것이 분석되는 coverslip에 준비가되어 있습니다. </li><li> 우리가 -1 각각 2,845센티미터 -1과 2천1백21cm 수, 진정제를 맞았을 포도당과 관련된 일반적으로 lipids와 관련된 CH 스트레치 모드, 그리고 CD 스트레치 모드의 스펙트럼 위치를 식별 DR - 자동차를 수행합니다. </li><li> 이 레이저 사이의 주파수 차이가 분자 진동의 주파수를 일치하면 일관된 래맨 산란이 이루어진다. 1,064 NM 레이저 빔과 1,064 nm의 광선과 함께 때 2,121센티미터 -1 정상 프로브 것입 868 nm의에 다른 OPO를 조정하여 결합하면 817의 NM으로 튜닝 한 OPO으로 그것은 2천8백45cm -1 CH 모드를 조사합니다 . </li><li> 으로 래스터 - 스캐닝 우리가 지금 관심의 세 일관된 래맨 신호를 관찰할 수있는 자동차 현미경에 샘플을. 자동차는 진동을 스트레칭 CH를 프로빙 신호, 차량 CD 스트레치 모드, 모두 프로빙 DR - 자동차 신호를 프로빙 신호. </li><li> 우리는 섹션 2.3에서 설명한대로 각 피크를 선택하고 위에 설명된대로 이미지를 가져가라. </li></ol> 5. 이미지 처리 이 세 가지 이미지에 따라 추가 정보를 추출하는 것은 이제 몇 가지 매우 간단한 이미지 프로세싱이 필요합니다. <ol><li> 먼저 이미지를 정상화해야합니다. 이론 정규화의 각 신호 생성 과정에 관여 각 레이저의 강도에 대한 회계에 의해 얻을 수 있습니다. 실제로, 그러나 이것은 항상 비 균일한 스펙트럼 반응으로 인해 주로 작동하지 않습니다이색성 거울, 감지기, 그리고 통같이니다. </li><li> 정상화를위한 실용적인 방법은 순수한 lipids가 신호를 지배 지역에서 CD 공명 신호가 어떤 기여하지 말아야한다는 사실에 의존합니다. 마찬가지로, 순수한 포도당 솔루션의 지역 채널 공명 신호가 어떤 기여해서는 안됩니다. 마음이와 함께, 우리는 C. 밖에 잘 지역에 진정제를 맞았을 포도당 용액의 CD의 공명에서 얻은 DR - 자동차 이미지와 자동차 이미지를 정상화 어떤 채널 공진을 전시 없어야 엘레간스 웜. </li><li> 그럼 우리가 lipids 풍부하다 CH - 공진 자동차 이미지의 웜 내의 영역을 식별하고 표준 DR - 자동차 이미지 이내에 해당 지역에 정상화. 이 방법이 제대로 작동하기 위해서는 우리는이 지역 내의 깊은에는 진정제를 맞았을 포도당이 존재하지 않는 가정합니다. lipids은 소수성이며 솔루션을 혼합하지 않습니다 때문에 이것은 안전한 가정입니다. </li><li> 이제 표준 DR - 자동차 이미지에서 표준 CH - 공진 자동차 이미지를 빼서하여 우리는 그냥 증폭 CD - 공진 신호가 남아 있습니다. </li><li> 마찬가지로 표준 DR - FWM 이미지에서 표준 CD - 공진 자동차 이미지를 빼서하여 우리는 그냥 증폭 CH - 공진 신호가 남아 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 위에서 설명한 DR - 자동차 현미경 시스템의 다이어그램. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : C.의 화이트 빛 이미지 진정제를 맞았을 포도당 용액에 엘레간스 웜은 유리 coverslip에 대한 준비 및 이미징을위한 준비. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3 :. alkyne 수정을 (탄소 트리플 결합 탄소 그룹)가 포함되어 수정된 올레의 산성 (불포화 지방산)의 래맨 스펙트럼이 2천8백45cm -1과 2천1백센티미터에서 alkyne 공명에 강한 채널 resonances -1 모두 아르 잘 일관된 래맨 이미징에 이상적 마커 만들기, 지문 영역 (밀도 포장 봉우리의 지역)에서 고립. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4 :. 세 짧은 펄스 레이저가 시료 내에 overlapped 때 발생하는 일관된 래맨 신호의 일반적인 스펙트럼이 화살표는 에너지 도표로 표시 각 신호에 대한 책임 프로세스 (ES)를 가리 킵니다. 여기에 표시된 다이어그램에서 점선 화살표는 결과 신호를 나타내는 레이저와 OPO의와 고체 화살표에서 광자를 나타냅니다. 단단한 수평 라인 래맨 진동의 에너지를 표시하고 DR - 자동차, 동시에 프로브 두 개의 다른 래맨 진동을 같은 3 입력 광자 혼합, 시각적 표현을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5 : 이미징 C.에서 전형 결과 DR - 자동차와 자동차를 사용하여 엘레간스 벌레가. 맨 윗줄은 진정제를 맞았 포도당의 솔루션에 이미지 벌레를 그림 4에 표시된 세 가지 신호를 사용합니다. 두 번째 행에있는 이미지가 적절하게 표준화되었으며 세 번째 행에있는 차이 이미지는 DR - 자동차 이미지에서 자동차 이미지의 각을 빼서에 의해 생산되었다.

<ol><li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt+Soc+Am+B%22%5BJournal%5D)">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li>
<li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+%28CARS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li>
<li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophoton%22%5BJournal%5D)">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li>
<li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+%28DR-FWM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li>
<li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

래맨 분광법과 래맨 기반 이미징은 생체 과학의 강력한 새로운 도구입니다. 현재이 생체내와 lipids 처리 및 저장에 세포의 대사와 신진 대사 장애의 체외 연구에서 특히 사실입니다. 대부분의 바이오 macromolecules은 세포와 유기체에서 얻은 래맨 스펙트럼은 일반적으로 lipids, 단백질, 핵산, 당분의 기부금의 회선되도록 비슷한, 대부분 탄소 기반의 분자 채권의 큰 숫자를 포함하는 등 Lipids은 비교적 쉽습니다 때문에 밀도 방울이나 bilayers를 형성하기 위해 경향과 그들이 지방족 CH 채권의 큰 번호와 확장 체인을 포함하기 때문에, 이러한 복잡한 스펙트럼에서 분리합니다. 복잡한 세포 환경 내에서 특정 단백질, 아미노산, RNA 또는 DNA를 분리하는 능력은, 그러나 매우 제한됩니다. 관심이 분자는 아래에서만 μm의 농도에 존재하고있다면 이것은 특히 사실입니다. 여기, 우리의 새롭게 도입된 DR - 자동차의 차이 이미징 기술을 이용하여 약한 래맨 resonances을 탐사하는 능력은 그들의 화학 microanalysis 및 이미징을위한 잠재적으로 강력한 방법을 제공합니다. 틀림없이,이 프로토콜의 가장 복잡한 부분은 레이저 시스템의 정렬 및 동기화됩니다. 처음부터 시작하면, 펄스의 동기화, 즉 펄스가 그들이 펄스 autocorrelator의 사용에 의해 용이 걸릴 수있는 다른 경로에도 불구하고 시간에 overlapped 것을 보장. 일단 공간과 시간적 중복은 달성 자동차 DR - 자동차 신호를 쉽게 감지할 수 있어야합니다. 그러나, 최초의 정렬이 약하 신호의 결과로, 자주 원유입니다. 이 시스템을 잘 정렬을위한 가장 좋은 연습은 처음에 약한 신호를 생성하고 다음 각 경로를 따라 부드럽게 조정 거울 및 지연 단계를 사용하여 시간적 중복을 조정하여 신호 강도를 향상시키는 것입니다. , 룸 빛이 매우 효율적인 배플로 깨끗한 결과가 객실 조명으로 시스템을 운영함으로써 얻을 수있는 분광계 / 단색 행위가 비활성화 및 커튼 또는 렌즈 튜브는 다양한 광원 (예 : 컴퓨터 모니터의 도입 배경을 최소화하기 위해 있지만 표시기 조명, LED가 등). 우리의 특별한 설정은 단일 광자 계수의 눈사태 사진 다이오드 (APD) 감지기와 감지 5 시간 상관 단일 광자 계수 (TCSPC) 하드웨어를 활용합니다. 이것은 비교적 낮은 소음이 있지만 여러 그룹에서 비슷한 측정을 만드는 유리 가변 이득과 함께 사진 배율 튜브 (PMT의) 발견 매우 약한 신호를 감지할 수 있습니다. PMT의 장점은 그들이 가변 이득을 제공하고 검출기의 정렬을 단순화하는 수있는 훨씬 더 큰 탐지 영역을 가지고있다. 또한, 설치 프로그램은 빔 스캔을 달성하기 위해 목표를 번역 압전의 단계를 사용합니다. 이 장점은 우리가 정확도 높은 학위를 이전에 스캔한 이미지 이내에 현장으로 돌아가 자연 래맨 스펙트럼을 포함하여 추가적인 측정을 취할 수있는 능력을 가지고있다. 다른 그룹은 스캐닝 미러 어셈블리, 또는 훨씬 빠르게 이미지를 제공하고 있지만 정확하게 이미지 내의 임의의 위치로 돌아가려는 능력 제한됩니다 올림푸스 FluoView 시스템으로도 전체 공촛점 스캔 장치를 이용하여 성공적으로되었습니다. 래맨 공명도 몇 가지 최적화가 필요할 수도 있습니다 중요한 단계와 일치하도록 레이저를 튜닝. 래맨 봉우리가 DR - 자동차와 자동차에서 얻은 최대 스펙트럼 피크 강도를 알고있을 수 있지만 반드시 자연 래맨 피크의 최대과 일치하지 않습니다. 이것은 자연 래맨 스펙트럼에 대한 상대 차량의 스펙트럼 왜곡이 아닌 공진 배경 신호 및 차량에 최고의 안경 웨이브 혼합에 의해 생성된 신호의 본질적인 간섭 때문입니다. 자동차 신호의 피크 스펙트럼 위치 계산하지만,보다 실용적인 접근 방식 래맨 공명의 예상 위치에 걸쳐 여러 개의 작은 스펙트럼 단계 OPOs를 조정하는 것입니다 수 있습니다. 이 프로세스는 명확 최대를 얻을 것입니다. 사실, DR - FWM에서 가장 감성 모두를위한 resonances이 최대로 조정해야합니다. DR - 자동차 접근법 중 하나는 마지막으로 잠재적인 문제도 논의되어야, 즉 DR - 자동차 신호 래맨 활성 확장 분자의 균일한 분포에 따라 달라집니다. 대부분의 생물 학적 개체의 경우이 잘 풍부하고 거의 편재는 물에서 광범위한 오의 공명이 될 수 있습니다. 물 그러나, 지질 모드를 증폭하기 위해 물의 공명을 이용하면 얻은 신호의 왜곡을 선도하는 등 지질 방울로 세포와 소수성 영역, 대상에서 제외됩니다. 우리의 예제에서, 우리는 우리의 생물 학적 샘플에 대해 쉽게 감지하고 풍부한 신호를 생성하기 위해 진정제를 맞았 포도당의 솔루션을 사용하고 있습니다. 마찬가지로, 물을 진정제를 맞았 또는 생물 학적 buffe를 진정제를 맞았같은 D - HEPES로 RS는 사용할 수 있습니다. C. 이내 예제에서는 지질이 방울 엘레간스 웜은 항상 시스템의 초점을 맞춘 레이저 스폿 이내에 진정제를 맞았 포도당 솔루션과 lipids 모두 포함할 정도로 작은되었습니다. 그러나 이것은 일반적으로 사실이 아니다. 특정 예제는 세포질 내에 비교적 큰 지질 방울을 생성 adipocytes, 것입니다. 이 의미는 DR - 자동차 기술로 실시하는 실험 결과를 확인하는 신중 준비 및 제어 실험을 필요로합니다.

<table><tbody><tr><td>60X 수침 대물렌즈</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-71SIF-3</td><td></td></tr><tr><td>포켈스 셀(Pockels Cell)</td><td>ConOptics</td><td>350-160</td><td></td></tr><tr><td>피코트레인 펌프 레이저(Picotrain pump Laser)</td><td>HighQ</td><td>IC-1064-10000</td><td></td></tr><tr><td>광파라메트릭 발진기(Optical Parametric Oscillator)</td><td>APE</td><td>Levante IR</td><td></td></tr><tr><td>1.5 유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25cm&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>반파장판(Half-wave plates)</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>AHWP05M-980</td><td></td></tr><tr><td>편광 빔 분할기 큐브(Polarizing Beam Splitter Cubes)</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>PBS052 또는 PBS053</td><td></td></tr><tr><td>분광계/단색화 장치(Spectrometer/Monochromator)</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>Spectra Pro 2300i</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Princeton Instruments/Acton</td><td>PIXIS: 100B</td><td></td></tr><tr><td>아발란체 광다이오드(Avalanche Photo Diode)</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>SPCM-AGR-14-12691</td><td></td></tr><tr><td>XYZ 피에조 스테이지(XYZ Piezo Stage)</td><td>Physik Instruments</td><td>P 733-2CL P 721.CDQ</td><td>XY 스테이지와 Z 대물렌즈 홀더의 조합입니다.</td></tr><tr><td>다이크로익 미러(Dichroic Mirrors)</td><td>Semrock</td><td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td><td>이 특정 다이크로익 미러들은 필수적이지 않으며, 적절한 투과/반사 특성을 가진 세트라면 무엇이든 충분합니다.</td></tr><tr><td>다이크로익 미러(Dichroic Mirror)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Z830rdc</td><td>서로 다른 근적외선 레이저 빔을 결합하기 위함입니다.</td></tr><tr><td>TCSPC 보드</td><td>PicoQuant</td><td>Timeharp 200</td><td></td></tr><tr><td>Symphotime 이미징 소프트웨어</td><td>PicoQuant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

코히어런트 래맨 이미징 기술로 인해 높은 분자 특이성 1 라벨이없는 광학 이미징을 사용하는 그들의 약속에 대한 지난 10 년간 활동에 극적인 증가를 보았다. 이러한 기술의 감도 그러나, 밀리 어금니 분자 ​​농도의 1,2을 필요로하는, 형광보다 약한 정도의 많은 명령입니다. 여기, 우리는 강한 또는 풍부한 래맨 scatterers에서 얻은 자신의 신호를 증폭하여 래맨 - 활성 분자의 약하거나 낮은 농도의 검색을 활성화할 수 방법을 설명합니다. 생물 학적 샘플에서 짧은 펄스 레이저의 상호 작용은 샘플에 대한 고유의 화학적 정보를 가지고 각각의 일관된 래맨 산란 신호의 다양한 생성합니다. 일반적으로 이러한 신호, 예를 들어 일관된 안티 - 스톡 래맨 산란 (자동차)의 하나는 다른 사람이 폐기하는 동안 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 그러나, 3 색 자동차, 4 파 혼합 (FWM)를 포함한이 다른 신호, 수집 및 자동차 신호에 비해 때, 정보를 검색하는 데 그렇지 않으면 어려운 3을 추출하실 수 있습니다. 예를 들어, 이중 - 공진 자동차 (DR - 자동차) 2 공진 신호 4 사이에 건설적인 간섭의 결과입니다. 우리는 보여주는 방법 lipids에 2,845cm -1 CH 스트레치 진동 및 진정제를 맞았 분자 (예 : 진정제를 맞았 설탕, 지방산 등)의 2,120cm -1 CD 스트레칭 진동 DR - 자동차 신호를 생성하는 데 필요한 세 가지 레이저의 튜닝 동시에 래맨 resonances을 알아내기 위해 이용하실 수 있습니다. 이러한 조건에서, 각 공명 모두도 생성 탐색 결합 DR - 자동차 신호에서 차량 신호뿐만 아니라 인치 DR - 차량 신호와 약한 신호 감도를 향상하는 데 사용할 수있는 풍부한 분자의 진동에서 증폭 신호의 차이를 검출하는 방법 우리는 보여줍니다. 우리는 더 이상 이러한 접근 방식도 용매의 강한 래맨 신호를 사용하는 예를 들면 희석 용질의 약한 래맨 신호를 향상시킬 수있는 이러한 두 신호가 서로 다른 분자에서 생성된 응용 프로그램에 확장 것을 보여줍니다.

세 단일 파장 짧은 펄스 레이저의 조합 일관된 안티 - 스톡 래맨 산란 (자동차)과 이중 - 공진 자동차 (DR - 자동차)를 생성하는 데 사용됩니다. 이러한 신호의 차이점은 약한 래맨 scatterers의 이미징을함으로써 일관된 래맨 신호를 감지 않으면 어려운위한 향상된 감도를 제공합니다.

코히런트 라만 이미징 기술은 라벨 프리 광학 이미징을 가능하게 한다는 가능성 덕분에 지난 10년 동안 연구 활동이 급격히 증가했습니다...

이 영상에서는 일관된 라만 산란 신호를 가진 생물학적 구조와 관련된 두 가지 라만 공명(ramen resonances)의 차분 영상(differential imaging)을 수행하는 절차를 보여줍니다. 먼저, 동기화된 세 개의 단펄스 레이저를 시간적, 공간적으로 중첩시킵니다. 그 후 중첩된 펄스를 표준 도립 현미경으로 보내 미세 객체로부터 일관된 라만 신호를 생성합니다.생성된 서로 다른 라만 신호를 비교하기 위해 상용 소프트웨어를 사용하여 신호를 이미지로 변환합니다. 결과에 따르면, 이중 공명 및 단일 공명 라만 신호에서 얻은 이미지 간의 차이가 약한 라만 신호에 대해 향상된 민감도를 제공하는 것으로 나타났습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 바이오포토닉스 센터의 Tyler Weeks입니다.저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스의 바이오 포토닉스 센터 및 내과 전문의인 Thomas ER입니다. 오늘은 화학적으로 특이적인 세포 이미지를 생성하기 위해 이중 공명 일관성 안티-스토크스 라만 산란(doubly resonant coherent anti-stokes raman scattering)을 사용하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 일관성 안티-스토크스 라만 분광법만으로는 직접 검출하기에 너무 약한 분자들의 신호를 검출하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. CARS 및 Dr-CARS 신호를 동시에 생성하려면 튜닝 가능하고 동기화된 세 개의 단펄스 레이저 광원이 필요합니다. 이러한 동기화된 펄스를 얻기 위해, 먼저 출력 10 W, 고정 파장 1064 nm, 고정 펄스 길이 7 ps 및 고정 반복률 76 MHz의 단일 단펄스 레이저에서 시작합니다.일련의 반파장판과 편광 빔 분할 큐브를 사용하여 빔을 세 부분으로 분할합니다. 반파장판과 편광 빔 분할 큐브를 결합하면 빔의 방향을 바꾸지 않고도 각 성분의 출력량을 조절할 수 있습니다. 일반적으로 두 개의 빔은 각각 약 4.5 watts로 조정하며, 세 번째 빔에 나머지 1 watt가 포함되도록 합니다.그 후 두 개의 고출력 빔은 두 개의 독립적인 광 파라메트릭 발진기(OPO)로 유도됩니다. OPO는 서로 다른 주파수 생성을 이용하여 고에너지 광자를 서로 다른 파장을 가진 두 개의 저에너지 광자로 변환합니다. 이 효과를 구현하는 데 사용되는 결정의 온도를 조절함으로써, 생성된 광자의 파장을 0.1 nanometers 이내로 제어할 수 있습니다.이러한 신호들의 주파수를 두 배로 높임으로써, 1064 nanometers의 고정 파장을 가진 레이저를 동일한 1064 nanometer 광원을 사용하는 두 개의 별도 OPO에 펌핑하여 780 nanometers에서 910 nanometers 사이의 어느 지점으로든 튜닝 가능한 레이저 빔으로 변환할 수 있습니다. 이를 통해 원래의 펌프 레이저와 자동으로 동기화되는 두 개의 독립적으로 튜닝 가능한 레이저 광원을 얻게 됩니다. 1064 nanometer 펌프 레이저에서 나오는 세 번째 빔은 유전 거울의 조합을 통해 OPO 주변으로 유도되어, 나중에 세 빔이 모두 다시 결합될 수 있도록 합니다.일관된 라만 신호 광자를 효율적으로 생성하기 위해서는 결합된 펄스들이 시간적 및 공간적으로 모두 중첩되어야 합니다. OPO는 각 레이저 펄스가 결정을 여러 번 통과할 수 있도록 하는 링 캐비티를 포함하고 있으므로, OPO를 통해 전송된 빔은 추가 거리를 이동하게 되어 원래의 펌프 빔에 비해 상당한 지연이 발생합니다. 이 거리는 세 번째 빔을 통해 보정되어야 하며, 다이크로익 미러를 사용하여 빔들을 재결합하기 전에 이 빔이 다른 두 빔과 동일한 거리를 이동하도록 유도하는 추가 미러를 도입함으로써 경로 길이를 미세하게 조정할 수 있습니다. 각 빔은 조절 가능한 지연 스테이지를 통과하며, 이를 통해 서로 다른 레이저 펄스들의 시간적 중첩을 조정할 수 있습니다.각 빔의 레이저 출력을 독립적으로 조절하기 위해 반파장판 세트와 편광 빔 분할기 큐브를 각 빔에 추가합니다. 다이크로익 미러를 사용하여 먼저 두 OPO의 빔을 결합한 다음 1064 nanometer 빔을 결합하며, 이때 빔들이 공간상에서 정밀하게 겹치도록 주의해야 합니다. 이는 다이크로익 미러에서 수 cm 이내의 빔 중첩 상태와 약 1 meter 거리에서의 중첩 상태를 비교함으로써 확인할 수 있습니다.평균 출력값이 높은 레이저 빔에 노출되면 시료가 손상될 수 있으므로, 결합된 세 개의 빔은 펄스 피커(pulse picker) 역할을 하는 전기 광학 변조기를 통과합니다. 이를 통해 시료에 도달하는 펄스의 반복률을 조절함으로써 평균 출력을 조정할 수 있습니다. 그 후, 결합된 레이저 빔은 높은 개구수(numerical aperture 또는 na)를 가진 대물렌즈가 장착된 도립 현미경으로 결합됩니다. 높은 NA 대물렌즈에 의해 형성된 조밀한 초점은 미세한 길이 스케일에서 코히런트 라만 신호를 가장 효율적으로 생성할 수 있게 합니다.현미경의 대물렌즈는 X, Y, Z 피조 스테이지(pizo stage)에 장착되어 있어, 상용 빔 스캐닝 공초점 현미경과 유사하게 빔을 시료 전체에 래스터 스캐닝하여 이미지를 얻을 수 있습니다. 이제 CARS 및 DRFWM 신호를 생성하는 방법을 살펴보겠습니다. 시료에서 세 개의 짧은 펄스 레이저 빔이 상호작용하면, 두 개의 레이저가 다양하게 조합되어 발생하는 CARS와 같은 여러 사파동 혼합(four wave mixing) 신호를 비롯하여, 세 가지 레이저가 모두 조합된 3색 CARS 및 DR CARS 신호가 생성됩니다. 신호들의 파장이 서로 매우 가까울 경우, 분석을 위해 이를 분리하는 것이 어려울 수 있습니다.이러한 이유로, 신호는 단색화 장치 또는 밴드 패스 필터 역할도 겸하는 이미징 분광계로 전달되어 서로 다른 파장의 신호를 공간적으로 분리합니다. 분광계 내부에 전자적으로 구동되는 플립 미러가 내려간 상태에서는 신호가 후면 조사형 딥 디플리션 전하 결합 소자 또는 CCD 카메라로 전달됩니다. 이 카메라는 전체 신호 범위에 걸친 분광 정보를 제공하며, 이를 통해 다양한 코히런트 로빈 신호를 식별 및 최적화하여 이미징할 신호를 선택할 수 있습니다. 공급업체에서 제공한 제어 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 분광계 내의 격자를 회전시키면, 관심 있는 피크를 CCD 카메라의 중심에 맞출 수 있습니다.그다음 플립 미러의 위치를 변경하여 신호를 단일 광자 계수 아발란체 광다이오드(APD) 또는 PD가 연결된 두 번째 출력 포트로 리다이렉트합니다. 대물렌즈를 래스터 스캔하고, APD에서 기록된 신호를 사용하여 데이터 획득 소프트웨어로 각 픽셀의 광자 계수율을 표시함으로써 이미지를 생성합니다. 이 이미징 절차를 원하는 각 코히어런트 라만 신호에 대해 반복하여, 사후 처리 과정에서 신호들을 비교할 수 있도록 합니다.이제 명확하고 재현 가능한 이미지를 얻기 위해 샘플을 적절하게 준비하는 방법을 살펴보겠습니다. 샘플 준비 시 몇 가지 주의 사항이 있습니다. 샘플은 일반적으로 두께가 약 150 micron인 유리 커버슬립 위에 준비합니다.이 커버 슬립은 본 실험에 사용되는 고 NA 수침 또는 유침 대물렌즈로 고해상도 이미징을 수행할 수 있을 만큼 충분히 얇습니다. 일반적인 시료 준비 과정을 보여드리기 위해, 현미경 슬라이드에 고정된 약 20 micron 두께의 마우스 근육 조직 절편을 준비합니다. 여기에 5 molar 중수소화 포도당 용액 20 microliter 한 방울을 시료에 첨가합니다.중수소화 포도당 용액은 독특하고 강력한 라만 배경 시그니처를 제공합니다. 샘플 위에 유리 커버슬립을 얹고 매니큐어를 사용하여 세포 및 배양 상태로 고정합니다. 세포 배양 성장 접시에서 세포를 분리할 필요 없이 이미징이 가능한 유리 바닥 배양 접시를 사용할 수 있습니다.이제 Dr cars에 적절한 라만 피크를 결정하는 방법을 살펴보겠습니다. 이중 공명 증강 효과를 제대로 활용하기 위해서는 두 라만 공명 물질의 라만 스펙트럼을 알고 있어야 합니다. 일반적으로 지질과 관련된 2,845 cm⁻¹과 중수소화된 포도당의 CD 신축 모드와 관련된 2,121 cm⁻¹이 이에 해당합니다.두 레이저 사이의 주파수 차이가 분자 진동 주파수와 일치할 때 일관성 라만 산란이 발생합니다. 한 OPO를 817 nanometers로 튜닝하면 1064 nanometer 레이저 빔과 결합하여 2,845 inverse centimeters C 모드를 측정하게 되며, 다른 OPO를 868 nanometers로 튜닝하면 1064 nanometer 빔과 결합하여 2,121 inverse centimeter를 측정하게 됩니다. 분광 모드에서 CARS 현미경을 통해 우리가 관심을 갖는 세 가지 일관성 라만 신호를 관찰할 수 있는데, 이는 CH 신축 진동을 측정하는 CARS 신호, CD 신축 모드를 측정하는 CARS 신호, 그리고 두 가지 모두를 측정하는 DR CARS 신호입니다. 여기 표시된 도식에서 점선 화살표는 OPO 내 레이저의 광자를 나타내며, 실선 화살표는 결과적으로 발생하는 신호를 나타냅니다.실선 수평선은 라만 진동의 에너지를 나타내며, DR 카에서는 동일한 세 개의 입력 광자를 혼합하여 두 개의 서로 다른 라만 진동을 동시에 탐색한다는 것을 시각적으로 보여줍니다. 각 피크의 신호 강도는 이 피크 위치 주변을 미세한 단계로 조정하여 최적화해야 합니다. 여기서는 각 피크를 선택하고 저농도 포도당 용액 내의 sea elgan worms 이미지를 촬영하며, 이렇게 개별적으로 얻은 세 개의 이미지를 기반으로 추가 정보를 추출하려면 상당히 간단한 이미지 프로세싱이 필요합니다.먼저, 이미지를 정규화해야 합니다. 정규화를 위한 실용적인 방법은 지질이 소수성이라는 사실에 기반합니다. 이는 지질 밀도가 높은 영역에서는 포도당의 CD 공명이 이중 공명 신호에 거의 기여하지 않음을 의미합니다.반대로, 순수 포도당 용액 영역에서는 지질의 CH 공명 또한 거의 기여하지 않아야 합니다. 이를 염두에 두고, DR car 이미지와 중수소화 포도당 용액의 CD 공명에서 얻은 car 이미지를 CH 공명이 나타나지 않아야 하는 CL egan's worm 외부의 영역을 기준으로 정규화하십시오. 다음으로, CH 공명 car 이미지 내의 worm 영역 중 지질이 풍부한 부위를 찾아 이를 정규화된 DR car 이미지의 해당 영역에 맞춰 정규화하십시오.이 방법이 제대로 작동하려면, 이 영역의 깊은 곳에 중수소화 포도당이 존재하지 않는다고 가정합니다. 지질은 소수성이며 용액과 섞이지 않으므로 이는 타당한 가정입니다. 이제 정규화된 DR car 이미지에서 정규화된 CH 공명 car 이미지를 빼면 증폭된 CD 공명 신호만 남게 되며, 마찬가지로 정규화된 Dr.FWM 이미지에서 정규화된 CD 공명 car 이미지를 빼서 구할 수 있습니다.증폭된 CH 공명 신호만 남겨둔 여기 표시된 것은 알킨 수식이 포함된 변형 올레산의 라만 스펙트럼입니다. 2,845 cm⁻¹에서의 강한 CH 공명과 2,121 cm⁻¹에서의 알킨 공명은 모두 피크가 밀집된 영역인 지문 영역으로부터 잘 분리되어 있어, 코히런트 라만 이미징을 위한 이상적인 마커가 됩니다. 이것은 세 개의 짧은 펄스 레이저가 시료 내에서 중첩될 때 생성되는 전형적인 코히런트 라만 신호의 스펙트럼입니다. 화살표는 에너지 도표로 표현된 각 신호의 원인이 되는 과정을 가리킵니다.이 결과들은 DR CARS 및 CARS를 사용하여 C Elgin의 벌레를 이미징한 전형적인 결과입니다. 첫 번째 행에서는 앞서 보여드린 세 가지 신호를 사용하여 저농도 glucose 용액 내의 벌레를 이미징했습니다. 두 번째 행에서는 이미지들을 적절하게 정규화하였으며, 세 번째 행에서는 DR CARS 이미지에서 각각의 CARS 이미지를 빼줌으로써 차이 이미지를 생성하였습니다. 지금까지 이중 공명 결맞음 안티 스토크스 라만 현미경법(doubly resonant coherent antis Raman microscopy)을 기반으로 라만 차이 이미징을 수행하는 방법을 설명해 드렸습니다.이 절차를 수행할 때 빔이 적절하게 중첩되고 동기화되었는지 확인하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 또한, 서로 다른 코히어런트 신호 간에 전환할 때 시료를 쳐서 움직이지 않도록 주의하십시오. 시료가 움직이면 분석에 영향을 미치기 때문입니다. 이상입니다.시청해주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: McCullagh, E. A., et al. 뇌 절편의 수초화 이미징을 위한 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 적용. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 설치류 뇌 조직의 신경 구조를 시각화하기 위한 형광 및 CARS(Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy) 이미징을 보여줍니다. Nissl 염색은 리보솜 RNA에 결합하여 세포체를 표지하는 반면, CARS 이미징은 레이저 유도 신호를 통해 지질이 풍부한 미엘린을 표적으로 삼습니다. 형광 및 CARS 이미지를 오버레이하면 세포체와 수초가 있는 축삭에 대한 자세한 보기를 제공합니다.

마우스 뇌 조직에서 수초 뉴런을 시각화하기 위한 Coherent Anti-Stokes Raman 분광법

코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경은 현장과 용해를받은 의약품 정제의 표면을 실시간으로 시각화 수 있도록 고유의 흐름을 통해 용해 설정과 결합됩니다. 이 사용자 정의 - 기본 설정을 사용하여, 인라인 UV 흡수 분광법을 사용하여 촬영 한 약물 용출 프로파일을 가진 차 비디오의 상관 관계를 할 수 있습니다.

해산 동안 일관된 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 시각화 제약 정제

분자 결합의 고유 진동에 따라 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 현미경 레이블없는 화학적으로 선택적 라이브 세포 이미징을 허용합니다. 사파이어 레이저와 OPO 레이저 본 작업은 펨토초의 Ti에 기초한 표준 광자 레이저 스캐닝 현미경에 상보 현미경 기술의 구현을 제공한다.

사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

자극라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 특정 화학 적 moieties의 선택적, 라벨없는 이미징을 허용하고 효과적으로 생체 내에서 지질 분자를 이미지하기 위해 사용되었습니다. 여기에서, 우리는 SRS 현미경 검사법의 원리에 대한 간략한 소개를 제공하고 Caenorhabditis elegans에있는 지질 저장에 그것의 사용을 위한 방법을 기술합니다.

자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

자극된 라만 산란(SRS) 현미경은 강력하고 비파괴적이며 라벨이 없는 이미징 기술입니다. 한 가지 새로운 응용 분야는 자극 라만 조직학이며, 여기서 단백질과 지질 라만 전이에서 두 가지 컬러 SRS 이미징이 의사 헤마톡실린 및 에오신 이미지를 생성하는 데 사용됩니다. 여기에서는 조직 진단을 위한 실시간 이색 SRS 이미징을 위한 프로토콜을 시연합니다.

조직 진단을 위한 마우스 뇌의 실시간 두 가지 색상 자극 라만 산란 영상

무지개 유사 라만 염료의 전자 사전 공명 자극 라만 산란 (epr-SRS) 이미징은 고도로 다중화 된 에피토프 기반 단백질 이미징을위한 새로운 플랫폼입니다. 여기에서는 항체 준비, 조직 샘플 염색, SRS 현미경 어셈블리 및 epr-SRS 조직 이미징을 포함한 실용적인 가이드를 제시합니다.

라만 염료를 이용한 고도의 다중화 조직 이미징

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

우리는 광대역 자극 라만 산란 (SRS) 현미경으로 화학 이미지를 획득하기위한 프로토콜을 제시합니다. 차등 다중 채널 잠금 검출로 작동하는 SRS 현미경을 기반으로 하는 프로토콜은 시료 준비, SRS 장치의 조정 및 화학적으로 이질적인 샘플의 서로 다른 구성 요소를 분리하기 위한 화학측정법을 설명합니다.

광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

수초화를 시각화하는 것은 신경계를 연구하는 많은 연구자들에게 중요한 목표입니다. CAS는 미엘린과 같은 특수 구조를 조명하는 뇌와 같은 조직 내에서 지질을 기본적으로 이미지화할 수 있는 면역형광법과 호환되는 기술입니다.

뇌 조각의 수초화 이미징을 위한 일관된 안티-스톡스 라만 분광법(CARS) 애플리케이션

label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

배우세요 이중-공진 코히어런트 반스톡스 래맨 산란(DR-CARS)을 이용한 생물학적 구조의 차등 영상법입니다. 세 개의 동기화된 단파장 레이저를 사용하여 약한 래만 신호의 감도를 높이고 세포의 화학적 특이 이미징을 제공하는 방법을 익히세요.

이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

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