이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

이 비디오에서는 일관된 라만 산란 신호를 가진 생물학적 구조와 관련된 두 가지 라만 공명에 대한 차분 이미징 수행 절차를 보여줍니다. 먼저, 동기화된 세 개의 짧은 펄스 레이저를 시간적 및 공간적으로 중첩시킵니다. 이렇게 중첩된 펄스는 표준 도립 현미경으로 보내지며, 이를 통해 미세 객체로부터 일관된 라만 신호를 생성할 수 있습니다.

생성된 서로 다른 라만 신호를 비교하기 위해 상용 소프트웨어를 사용하여 신호를 이미지로 변환합니다. 결과는 이중 공명 라만 신호와 단일 공명 라만 신호로부터 얻은 이미지 간의 차이가 약한 라만 신호에 대해 향상된 민감도를 제공한다는 것을 보여줍니다. 안녕하세요, 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 바이오 포토닉스 센터의 Tyler Weeks입니다.

저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스의 바이오 포토닉스 센터 및 내과 전문의 토마스 ER입니다. 오늘은 세포의 화학적 특이적 이미지를 생성하기 위해 이중 공진 코히런트 안티 스토크 라만 산란(doubly resonant coherent anti-Stokes Raman scattering)을 사용하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 코히런트 안티 스토크 라만 분광법만으로는 직접 검출하기에 신호가 너무 약한 분자들의 신호를 검출하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작하겠습니다. CARS 및 Dr CARS 신호를 동시에 생성하려면 튜닝 가능하고 동기화된 3개의 짧은 펄스 레이저 소스가 필요하며, 이러한 동기화된 펄스를 얻어야 합니다. 출력 전력이 10 watts, 고정 파장이 1064 nanometers, 고정 펄스 길이가 7 picoseconds, 고정 반복률이 76 megahertz인 단일 짧은 펄스 레이저로 시작하십시오.

일련의 반파장판과 편광 빔 분할기 큐브를 사용하여 빔을 세 부분으로 분할합니다. 반파장판과 편광 빔 분할기 큐브를 조합하면 빔의 방향을 바꾸지 않고 각 구성 성분의 출력량을 조절할 수 있습니다. 일반적으로 두 개의 빔은 각각 약 4.5 watts로 조절하며, 세 번째 빔에 나머지 1 watt가 포함되도록 합니다.

그 다음 두 개의 고출력 빔을 두 개의 독립적인 광 파라메트릭 발진기(OPO)로 보냅니다. OPO는 서로 다른 주파수 생성을 이용하여 고에너지 광자를 서로 다른 파장을 가진 두 개의 저에너지 광자로 변환합니다. 이 효과를 구현하는 데 사용되는 결정의 온도를 제어함으로써, 결과적으로 생성되는 광자의 파장을 0.1 nanometers 이내로 정밀하게 조절할 수 있습니다.

이러한 신호들의 주파수를 두 배로 높임으로써, 1064 nanometers의 고정 파장을 가진 레이저를 동일한 1064 nanometer 광원으로 두 개의 별도 OPO를 펌핑하여 780 nanometers에서 910 nanometers 사이의 어느 범위로든 튜닝 가능한 레이저 빔으로 변환할 수 있습니다. 이를 통해 원래의 펌프 레이저와 자동으로 동기화되는 두 개의 독립적으로 튜닝 가능한 레이저 광원을 얻게 됩니다. 1064 nanometer 펌프 레이저에서 나오는 세 번째 빔은 유전 거울의 조합을 통해 OPO 주변으로 유도되어, 나중에 세 개의 빔이 모두 재결합될 수 있도록 합니다.

일관된 라만 신호 광자를 효율적으로 생성하기 위해서는 재결합되는 펄스들이 시간적 및 공간적으로 중첩되어야 합니다. OPO는 각 레이저 펄스가 결정을 여러 번 통과할 수 있게 하는 링 공동(ring cavity)을 포함하고 있어, OPO를 통과한 빔은 추가 거리를 이동하게 되며 이로 인해 원래의 펌프 빔에 비해 상당한 지연이 발생합니다. 이러한 거리는 세 번째 빔을 통해 보정되어야 하며, 다이크로익 미러(dichroic mirror)를 사용하여 재결합하기 전 이 빔이 다른 두 빔과 동일한 거리를 이동하도록 유도하는 추가 미러를 도입함으로써 경로 길이를 미세하게 조정할 수 있습니다. 각 빔은 조정 가능한 지연 스테이지(delay stage)를 통과하며, 이를 통해 서로 다른 레이저 펄스들의 시간적 중첩을 조정할 수 있습니다.

각 빔의 레이저 출력을 독립적으로 조절할 수 있도록 반파장판과 편광 빔 분할기 큐브 세트를 각 빔에 추가합니다. 다이크로익 미러를 사용하여 먼저 두 OPO의 빔을 결합한 다음, 1064 nanometer 빔을 결합하며, 이때 빔들이 공간상에서 정밀하게 겹치도록 주의해야 합니다. 이는 다이크로익 미러에서 수 cm 거리에서의 빔 중첩 상태와 다이크로익 미러에서 약 1 m 거리에서의 중첩 상태를 비교함으로써 확인할 수 있습니다.

높은 평균 출력의 레이저 빔에 노출되면 시료가 손상될 수 있으므로, 결합된 세 개의 빔은 펄스 피커(pulse picker) 역할을 하는 전기 광학 변조기를 통과합니다. 이를 통해 시료에 도달하는 펄스의 반복률을 조절할 수 있으며, 결과적으로 평균 출력을 제어할 수 있습니다. 이후 결합된 레이저 빔은 높은 개구수(numerical aperture 또는 na)를 가진 대물렌즈가 장착된 도립 현미경으로 결합됩니다. 높은 NA 대물렌즈에 의해 생성된 정밀한 초점은 미세한 길이 규모에서 일관된 라만 신호를 가장 효율적으로 생성할 수 있게 합니다.

현미경의 대물렌즈는 X, Y, Z 피조 스테이지(pizo stage)에 장착되어 있어, 상용 빔 스캐닝 공초점 현미경과 유사하게 빔을 시료 전체에 래스터 스캐닝하여 이미지를 얻을 수 있습니다. 이제 CARS 및 DRFWM 신호를 생성하는 방법을 살펴보겠습니다. 시료에서 세 개의 짧은 펄스 레이저 빔이 상호작용하면, 두 개의 레이저가 결합된 다양한 조합으로 인한 CARS와 같은 여러 사파동 혼합 신호뿐만 아니라, 세 가지 레이저가 모두 결합되어 발생하는 3색 CARS 및 DR CARS 신호가 생성됩니다. 신호들의 파장이 상대적으로 가깝기 때문에 분석을 위해 이들을 분리하는 것이 어려울 수 있습니다.

이러한 이유로, 신호는 단색화 장치 또는 밴드 패스 필터의 역할도 수행하는 이미징 분광계로 전달되어 서로 다른 파장의 신호를 공간적으로 분리합니다. 분광계 내에 전자적으로 작동되는 플립 미러가 내려간 위치에 있을 때 신호가 후면 조사형 딥 디플리션 전하 결합 소자 또는 CCD 카메라로 전달되며, 이를 통해 전체 신호 범위에 걸친 분광 정보를 제공받아 다양한 코히런트 로빈 신호를 식별 및 최적화함으로써 이미징할 신호를 선택할 수 있습니다. 공급업체에서 제공하는 제어 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 분광계 내의 그레이팅을 회전시키면 관심 피크를 CCD 카메라의 중심에 맞출 수 있습니다.

그런 다음 플립 미러의 위치를 변경하여 신호를 단일 광자 계수 아발란체 광다이오드(APD) 또는 PD가 연결된 두 번째 출력 포트로 리다이렉트합니다. 대물렌즈를 래스터 스캔하고, 데이터 획득 소프트웨어로 각 픽셀의 광자 계수율을 표시하여 APD에 기록된 신호로 이미지를 생성합니다. 후처리 과정에서 신호를 비교할 수 있도록 원하는 각 일관성 라만 신호에 대해 이 이미징 절차를 반복합니다.

이제 선명하고 재현 가능한 이미지를 얻기 위해 샘플을 적절하게 준비하는 방법을 살펴보겠습니다. 샘플 준비 시 몇 가지 주의가 필요합니다. 샘플은 일반적으로 두께가 약 150 micron인 유리 커버슬립 위에 준비합니다.

이 커버 슬립은 본 실험에 사용되는 고개구수(NA) 수침 또는 유침 대물렌즈를 통한 고해상도 이미징이 가능할 만큼 충분히 얇습니다. 전형적인 시료 준비 과정을 보여주기 위해, 현미경 슬라이드에 고정된 약 20 micron 두께의 마우스 근육 조직 절편을 준비합니다. 여기에 5 molar 중수소화 포도당 용액 20 microliter 한 방울을 시료에 첨가합니다.

중수소화 포도당 용액은 독특하고 강한 라만 배경 시그니처를 제공합니다. 세포 및 배양 시료의 상단에 유리 커버슬립을 올리고 매니큐어로 고정합니다. 세포 배양 성장 접시에서 세포를 분리할 필요 없이 이미징이 가능한 유리 바닥 배양 접시를 사용할 수 있습니다.

이제 Dr cars를 위한 적절한 라만 및 피크를 결정하는 방법을 알아보겠습니다. 이중 공명 증강 효과를 적절하게 활용하기 위해서는 두 라만 공명 물질의 라만 스펙트럼을 모두 알고 있어야 합니다. 일반적으로 지질과 관련된 2,845 cm⁻¹과 중수소화된 포도당의 CD 신축 모드와 관련된 2,121 cm⁻¹이 이에 해당합니다.

두 레이저 사이의 주파수 차이가 분자 진동 주파수와 일치할 때 일관성 라만 산란이 발생합니다. 한 OPO를 817 nanometers로 튜닝하면 1064 nanometer 레이저 빔과 결합하여 2,845 inverse centimeters C 모드를 탐색하며, 다른 OPO를 868 nanometers로 튜닝하면 1064 nanometer 빔과 결합하여 2,121 inverse centimeter를 탐색합니다. 분광 모드에서 CARS 현미경을 통해 관심 있는 세 가지 일관성 라만 신호를 관찰할 수 있는데, 이는 CH 신축 진동을 탐색하는 CARS 신호, CD 신축 모드를 탐색하는 CARS 신호, 그리고 두 가지 모두를 탐색하는 DR CARS 신호입니다. 여기 표시된 도식에서 점선 화살표는 OPO의 레이저로부터 오는 광자를 나타내며, 실선 화살표는 그 결과로 발생하는 신호를 나타냅니다.

실선 가로선은 라만 진동의 에너지를 나타내며, DR 카에서는 동일한 세 개의 입력 광자를 혼합함으로써 동시에 두 개의 서로 다른 라만 진동을 탐사한다는 것을 시각적으로 보여줍니다. 각 피크의 신호 강도는 이러한 피크 위치 주변을 미세한 단계로 조정하여 최적화해야 합니다. 여기서는 각 피크를 선택하고 저농도 포도당 용액에 있는 바다꼬마벌레(sea elgan worms)의 이미지를 촬영하며, 이렇게 개별적으로 얻은 세 개의 이미지를 기반으로 추가 정보를 추출하려면 상당히 간단한 이미지 처리가 필요합니다.

먼저, 이미지를 정규화해야 합니다. 정규화를 위한 실용적인 방법은 지질이 소수성이라는 사실에 기반합니다. 이는 지질 밀도가 높은 영역에서는 포도당에 의한 CD 공명이 이중 공명 신호에 거의 기여하지 않음을 의미합니다.

반대로, 순수 포도당 용액 영역에서는 지질의 CH 공명 또한 거의 기여하지 않아야 합니다. 이를 염두에 두고, DR 이미지와 중수소화 포도당 용액의 CD 공명에서 얻은 이미지를 CH 공명이 나타나지 않아야 하는 C. elegans 벌레 외부의 영역을 기준으로 정규화하십시오. 다음으로, CH 공명 이미지에서 지질이 풍부한 벌레 내부의 영역을 식별하고, 이를 정규화된 DR 이미지 내의 해당 영역에 맞추어 정규화하십시오.

이 방법이 제대로 작동하려면 이 영역의 깊은 곳에는 중수소화 포도당이 존재하지 않는다고 가정합니다. 지질은 소수성이라 용액과 섞이지 않으므로 이는 안전한 가정입니다. 이제 정규화된 DR car 이미지에서 정규화된 CH 공명 car 이미지를 빼면 증폭된 CD 공명 신호만 남게 되며, 마찬가지로 정규화된 Dr.FWM 이미지에서 정규화된 CD 공명 car 이미지를 빼서 구할 수 있습니다.

증폭된 CH 공명 신호만 표시되어 있습니다. 여기는 알킨 수식이 포함된 변형 올레산의 라만 스펙트럼으로, 2,845 cm⁻¹의 강한 CH 공명과 2,121 cm⁻¹의 알킨 공명은 모두 피크가 밀집된 영역인 지문 영역과 잘 분리되어 있어 일관성 라만 이미징을 위한 이상적인 마커가 됩니다. 이는 세 개의 짧은 펄스 레이저가 시료 내에서 중첩될 때 생성되는 전형적인 일관성 라만 신호 스펙트럼입니다. 화살표는 에너지 도표로 표현된 각 신호의 원인이 되는 공정을 가리킵니다.

이것은 DR CARS 및 CARS를 사용하여 C Elgin의 벌레를 이미징한 전형적인 결과입니다. 첫 번째 행은 방금 보여드린 세 가지 신호를 사용하여 저농도 포도당 용액 내의 벌레를 이미징한 것입니다. 두 번째 행의 이미지들은 적절하게 정규화되었으며, 세 번째 행의 차이 이미지는 DR CARS 이미지에서 각 CARS 이미지를 감산하여 생성되었습니다. 우리는 방금 이중 공명 가간섭 안티 스토크스 라만 현미경 기반의 라만 차이 이미징을 수행하는 방법을 보여드렸습니다.

이 절차를 수행할 때, 빔들이 적절하게 중첩되고 동기화되었는지 확인하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 또한, 서로 다른 코히런트 신호 사이를 전환할 때 시료를 치거나 움직이지 않도록 주의하십시오. 이는 분석 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 이상입니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.