이중 - 공진 코히어런트 반 스톡스 래맨 산란 (자동차)와 생물 학적 구조의 차동 영상

이 비디오는 코히어런트 라멘 산란 신호로 생물학적 구조와 관련된 두 개의 라멘 공명에 대한 차등 이미징을 수행하는 절차를 보여줍니다. 처음 3개의 동기화된 짧은 펄스 레이저는 시간과 공간에서 중첩됩니다. 그런 다음 중첩된 펄스는 표준 도립 현미경으로 전송되어 미세한 물체에서 일관된 라면 신호를 생성할 수 있습니다.

신호는 생성된 다양한 라면 신호를 비교하기 위해 상용 소프트웨어를 사용하여 이미지로 변환됩니다. 결과는 이중 및 단일 공진 라면 신호에서 얻은 이미지 간의 차이가 약한 라면 신호에 대해 향상된 감도를 제공한다는 것을 나타냅니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스(University of California Davis)의 바이오 포토닉스 센터(Center for Bio Photonics)의 타일러 윅스(Tyler Weeks)입니다.

저는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스(University of California Davis)의 바이오 포토닉스 센터(Center for Bio Photonics) 및 내과(Department of Internal Medicine)의 토마스 응급실(Thomas ER)입니다. 오늘은 세포의 화학적으로 특이적인 이미지를 생성하기 위해 이중 공명, 코히어런트, 안티 스톡스, 라면 산란을 사용하는 절차를 보여 드리겠습니다. 우리는 이 절차를 사용하여 너무 약해서 코히어런트 안티 스톡스 라몬 분광법만으로는 직접 감지할 수 없는 분자의 신호를 감지합니다.

자, 시작하겠습니다: 자동차와 Dr 자동차 신호를 동시에 생성하려면 이러한 동기화된 펄스를 얻기 위해 세 개의 조정 가능하고 동기화된 짧은 펄스 레이저 소스가 필요합니다. 10와트의 출력 전력을 가진 단일 짧은 펄스 레이저로 시작하십시오. 1064나노미터의 고정 파장, 7피코초의 고정 펄스 길이, 76메가헤르츠의 고정 반복률.

일련의 반파 플레이트와 편광 빔 스플리터 큐브를 사용하여 빔은 세 부분으로 나뉩니다. 편광 빔 스플리터 큐브와 결합된 중간 플레이트를 사용하면 방향을 변경하지 않고 빔의 각 구성 요소에서 출력량을 조정할 수 있습니다. 전형적으로, 2개의 빔은 각각 대략 4.5와트로 조정되고, 제3 빔은 나머지 1와트를 포함한다.

그런 다음 두 개의 고출력 빔은 두 개의 독립적인 광학 파라메트릭 발진기 또는 OPO로 향합니다. OPO는 서로 다른 주파수 생성을 사용하여 고에너지 광자를 파장이 다른 두 개의 저에너지 광자로 변환합니다. 이 효과를 달성하는 데 사용되는 결정의 온도를 제어함으로써 생성된 광자의 파장을 0.1나노미터 이내로 제어할 수 있습니다.

이러한 신호를 주파수를 두 배로 늘리면 1064나노미터의 고정 파장을 가진 레이저가 이제 동일한 1064나노미터 소스로 두 개의 개별 OPO를 펌핑하여 780나노미터에서 910나노미터 사이에서 조정할 수 있는 레이저 빔으로 변환될 수 있습니다. 두 개의 독립적으로 조정 가능한 레이저 소스가 얻어지며 이는 원래 펌프 레이저와 자동으로 동기화됩니다. 1064 나노미터 펌프 레이저의 세 번째 빔은 유전체 미러의 조합에 의해 OPO 주위로 향하므로 세 개의 빔이 모두 나중에 다시 결합될 수 있습니다.

일관성 있는 라면 신호 광자를 효율적으로 생성하기 위해서는 OPO에는 각 레이저 펄스가 OPO를 통해 전송된 빔이 추가 거리를 여러 번 이동하여 원래 펌프 빔에 비해 상당한 지연을 초래하는 링 캐비티가 포함되어 있기 때문에 재결합된 펄스가 시간적으로나 공간적으로 중첩되어야 합니다. 이 거리는 경로 길이를 미세 조정하기 위해 이색성 거울을 사용하여 재결합하기 전에 이 빔이 다른 두 빔과 동일한 거리를 이동하도록 하는 추가 미러를 도입하여 세 번째 빔으로 보상해야 합니다. 각 빔은 조정 가능한 지연 단계를 통해 전송되며, 이를 통해 서로 다른 레이저 펄스의 시간적 겹침을 조정할 수 있습니다.

또 다른 세트의 halfway plates와 polarizing beam splitter cubes가 각 빔에 추가되어 각 빔의 레이저 출력을 독립적으로 조정할 수 있습니다. 다이크로익 미러는 먼저 두 OPO의 빔을 결합하는 데 사용되며, 그런 다음 빔이 공간에서 정확하게 겹치도록 1064 나노미터 빔에 주의를 기울여야 합니다. 이는 이색성 거울의 수 cm 이내에 있는 빔의 겹침과 이색성 거울에서 약 1m 떨어진 빔의 겹침을 비교하여 확인할 수 있습니다.

높은 평균 출력의 레이저 빔에 노출되면 샘플이 손상될 수 있기 때문에 결합된 3개의 빔은 펄스 피커로 작동하는 전기 광학 변조기를 통해 전송되며, 이를 통해 샘플에 도달하는 펄스의 반복률을 조정할 수 있으므로 평균 출력을 조정할 수 있습니다. 그런 다음 결합된 레이저 빔을 높은 개구수 또는 na를 가진 대물 렌즈가 있는 도립 현미경에 결합합니다. 높은 NA 대물 렌즈에 의해 생성된 타이트한 초점은 미세한 길이 스케일에서 일관된 라면 신호를 가장 효율적으로 생성할 수 있습니다.

현미경의 대물 렌즈는 X, Y, Z pizo 스테이지에 장착되며, 이를 통해 상업용 빔 스캐닝, 컨포칼 현미경과 유사하게 샘플을 가로질러 빔을 래스터 스캔하여 이미지를 얻을 수 있습니다. 이제 자동차와 D-R-F-W-M 신호를 생성하는 방법을 살펴 보겠습니다.샘플에서 3 개의 짧은 펄스 레이저 빔의 상호 작용으로 인해 두 레이저의 다양한 조합에서 자동차와 같은 여러 개의 4 파장 혼합 신호가 생성되고 3 개의 레이저 조합에서 3 개의 컬러 자동차 및 DR 자동차 신호가 생성됩니다. 신호가 파장이 비교적 가까우면 분석을 위해 분리하기 어려울 수 있습니다.

이러한 이유로 신호는 서로 다른 파장에서 신호를 공간적으로 분리하기 위해 모노크로메이터 또는 대역 통과 필터 역할도 하는 이미징 분광계로 전달됩니다. 내려진 위치의 분광계 내의 전자 작동식 플립 미러는 신호를 후면 조명식 심층공핍 전하 결합 장치 또는 CCD 카메라로 전송하여 전체 신호 범위에 걸쳐 분광 정보를 제공하고 다양한 코히어런트 로빈 신호를 식별하고 최적화하여 이미징할 신호를 선택할 수 있습니다. 공급업체에서 제공하는 제어 및 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 분광계 내에서 그레이딩을 회전하기만 하면 CCD 카메라의 관심 피크를 중앙에 배치할

그런 다음 플립 미러의 위치를 변경하여 단일 광자 계수 눈사태 사진 DDE 또는 PD가 연결된 두 번째 출구 포트로 신호를 리디렉션합니다. 래스터. 대물 렌즈를 스캔한 다음 A PD에 기록된 신호를 사용하여 데이터 수집 소프트웨어로 각 픽셀에 대한 광자 계수율을 표시하여 이미지를 생성합니다. 원하는 각 코히어런트 라멘 신호에 대해 이 이미징 절차를 반복하여 후처리 중에 신호를 비교할 수 있습니다.

이제 선명하고 재현 가능한 이미지를 얻기 위해 샘플을 적절하게 준비하는 방법을 살펴보겠습니다. 샘플을 준비할 때 약간의 주의를 기울여야 합니다. 샘플은 일반적으로 약 150미크론 두께의 유리 커버 슬립에서 준비됩니다.

이러한 커버 슬립은 이러한 실험에 사용되는 높은 NA 물 또는 오일 이멀젼 대물 렌즈로 고해상도 이미징을 수행할 수 있을 만큼 충분히 얇습니다. 일반적인 샘플의 준비를 보여주기 위해 현미경 슬라이드에 고정된 약 20미크론 두께의 마우스 근육 조직 절편을 준비합니다. 20마이크로리터의 5몰 중수소화 포도당 용액 방울을 샘플에 첨가합니다.

중수소화 포도당 용액은 독특하고 강력한 라면 배경 시그니처를 제공합니다. 유리 커버 슬립을 샘플 위에 놓고 세포 및 배양을 위한 매니큐어로 제자리에 고정합니다. 세포 배양 접시에서 세포를 분리할 필요 없이 이미징이 가능한 유리 바닥 배양 접시를 사용할 수 있습니다.

이제 Dr 자동차에 적합한 럼과 피크를 결정하는 방법을 살펴보겠습니다. 이중 공명 강화 효과를 적절하게 활용하기 위해서는 두 라멘 공명 물질의 라면 스펙트럼을 알아야 합니다. 일반적으로 이들은 지질과 관련된 2, 845 inverse centimeter이고 중수소 포도당과 관련된 CD stretch mode의 경우 2, 121 inverse centimeters입니다.

코히어런트 라면 산란은 두 레이저 간의 주파수 차이가 분자 진동의 주파수와 일치할 때 달성됩니다. 하나의 OPO를 817나노미터로 조정하면 1064나노미터 레이저 빔과 결합될 때 2, 845 역센티미터 C 모드를 프로브하고 다른 OPO를 868나노미터로 조정하면 1064나노미터 빔과 결합될 때 2, 121 역센티미터를 프로브합니다. 분광 모드에서 자동차의 현미경을 통해 CH 스트레칭 진동을 프로빙하는 자동차 신호, CD 스트레치 모드를 프로빙하는 자동차 신호, DR 자동차 신호 프로빙 등 세 가지 코히어런트 라멘 신호를 관찰할 수 있습니다.

실선은 라면 진동의 에너지를 나타내며, DR 자동차에서 동일한 3개의 입력 광자를 혼합하면 두 개의 서로 다른 라면 진동을 동시에 프로브한다는 것을 시각적으로 표현합니다. 각 피크에 대한 신호 강도는 이러한 피크 위치 주변에서 미세한 단계로 조정하여 최적화해야 합니다. 여기서 우리는 각 피크를 선택하고 감소된 포도당 용액에서 바다 엘간 벌레의 이미지를 촬영하며, 개별적으로 얻은 이 세 가지 이미지를 기반으로 추가 정보를 추출하려면 상당히 간단한 이미지 처리가 필요합니다.

먼저 이미지를 정규화해야 합니다. 정규화를 위한 실용적인 방법은 지질이 소수성이라는 사실에 의존합니다. 이는 고밀도 지질 영역에서 포도당의 CD 공명이 이중 공명 신호에 거의 기여하지 않아야 함을 의미합니다.

반대로, 순수 포도당 용액 영역에서는 지질의 CH 공명도 거의 기여하지 않아야 합니다. 이를 염두에 두고 DR 자동차의 이미지와 중수소화 포도당 용액의 CD 공진에서 얻은 자동차의 이미지를 CH 공진을 나타내지 않아야 하는 CL egan의 웜 바깥 영역으로 정규화합니다. 다음으로, CH 공진 자동차 이미지에서 지질이 풍부한 웜 내 영역을 식별하고 정규화된 DR 자동차 이미지 내의 해당 영역으로 정규화합니다.

이 방법이 제대로 작동하려면 이 영역 깊숙한 곳에 중수소화 포도당이 존재하지 않는다고 가정합니다. 이것은 지질이 소수성이고 용액과 혼합되지 않기 때문에 안전한 가정입니다. 이제 정규화된 DR 자동차 이미지에서 정규화된 CH 공진 자동차 이미지를 빼면 정규화된 Dr.FWM 이미지에서 정규화된 CD 공진 자동차 이미지를 빼면 증폭된 CD 공진 신호만 유사하게 유지됩니다.

여기에 표시된 증폭 된 ch 공진 신호는 알킨 변형을 포함하는 변형 올레산에 대한라면 스펙트럼이며, 2, 845 역 센티미터의 강한 CH 공명과 2, 121 역 센티미터의 알파인 공명은 모두 조밀하게 채워진 피크 영역인 지문 영역과 잘 분리되어 있습니다. 코히어런트 라멘 이미징을 위한 이상적인 마커입니다. 이것은 샘플 내에서 3개의 짧은 펄스 레이저가 중첩될 때 생성되는 코히어런트 라면 신호의 일반적인 스펙트럼입니다. 화살표는 에너지 다이어그램으로 표시되는 각 신호를 담당하는 프로세스를 가리킵니다.

이것은 DR 자동차와 자동차를 사용하여 C Elgin의 벌레를 이미징한 일반적인 결과입니다. 맨 윗줄은 방금 표시된 세 가지 신호를 사용하여 저하된 포도당 용액에서 벌레를 이미지화했습니다. 두 번째 행에서는 이미지가 적절하게 정규화되었고 세 번째 행에서는 DR 자동차의 이미지에서 각 자동차의 이미지를 빼서 차이 이미지가 생성되었으며, 이중 공진 코히어런트 안티 라만 현미경을 기반으로 라만 차이 이미징을 수행하는 방법을 보여주었습니다.

이 절차를 수행할 때 빔이 적절하게 겹쳐지고 동기화되었는지 확인하는 것이 중요하다는 것을 기억하십시오. 또한 서로 다른 코히어런트 신호 간에 전환할 때 분석에 영향을 미치므로 샘플을 부딪치거나 이동하지 않도록 하십시오. 그게 다야.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.