활성 골수 - 유래 Macrophages과 Bradyzoite Toxoplasma gondii 약관의 낭종의 벽 형성

본 절차의 전반적인 목표는 In vitro에서 Toxoplasma gondii의 낭종벽 형성을 유도하고 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 대식세포와 섬유아세포를 배양함으로써 달성됩니다.

그런 다음 이러한 호스트 세포에 기생충을 감염시켜 pH 충격으로 섬유아세포를 자극하거나 대식세포를 활성화함으로써 낭종 내에서 스트레스 반응을 유도할 수 있으며, 이는 모두 낭종벽 형성으로 이어집니다. 마지막으로, 낭종벽에 결합하는 형광 렉틴을 배양액에 첨가하여 면역형광 현미경으로 낭종을 시각화할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 위스콘신 대학교 매디슨 캠퍼스 의생명 미생물학 및 면역학과의 Laura Noel 박사 연구실의 Crystal Tobin입니다.

저는 No Lab의 Angela Pollard입니다. 오늘은 시험관 내에서 Toxoplasma gondii 낭벽 형성을 유도하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 기생충이 스트레스 조건에 어떻게 반응하는지 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다.

이제 시작해 보겠습니다. 고pH 및 이산화탄소 결핍 조건에서 인간 포피 섬유아세포 내의 Toxoplasma gondii를 bradyzoite로 전환시키기 위해, 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰 바닥에 멸균된 원형 유리 커버슬립을 배치하는 것으로 시작하십시오. 조직 배양 후드 아래에서 confluent 상태인 150 cm² 플라스크의 인간 포피 섬유아세포를 준비하십시오.

합류된 human foreskin fibroblasts 플라스크를 1X PBS로 2회 헹군 후, 0.025% trypsin EDTA 2.5 milliliters를 첨가합니다. 플라스크를 37 degrees Celsius에서 5~10분 동안 배양합니다. 5~10분간의 배양 후, 플라스크를 여러 번 두드려 플라스틱 표면에서 세포를 분리합니다.

다음으로, 150 milliliters의 HFF 배지 또는 보충된 delcos modified eagles 배지를 첨가합니다. 이 배지를 사용하여 플라스크를 헹구고 세포를 수집합니다. 커버 슬립이 있는 24-well 플레이트의 각 웰에 세포 1 milliliter씩을 분주하고, 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 세포가 confluent 상태가 될 때까지 배양합니다.

이제 세포를 Toxoplasma Gandhi 기생충으로 감염시킬 준비가 되었습니다. 조직 배양 후드 내에서, 합류(confluent) 상태의 인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblasts)가 들어 있는 25 square centimeter 플라스크에 2 × 10⁶마리의 기생충을 감염시키고, 세포가 용해되기 시작할 때까지 37 °C에서 배양합니다. 약 2~3일 후, 세포 스크레이퍼를 사용하여 조직 배양 플라스크에서 감염된 포피 섬유아세포 단층을 제거합니다.

그런 다음, 떨어져 나온 단층 세포를 27 gauge 바늘로 통과시켜 숙주 세포로부터 기생충을 분리합니다. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 배지 내 기생충 수를 결정한 후, 미리 준비된 합류된 인간 포피 섬유아세포(human foreskin fibroblasts)의 24개 웰 각각에 10⁵마리의 기생충을 감염시킵니다.

기생충이 숙주 세포로 침투할 수 있도록 세포를 37°C, 5% carbon dioxide 조건에서 3시간 동안 배양합니다. 이어서 기생충이 Brady Zeolite 단계로 전환되도록 유도합니다. 감염된 인간 포피 섬유아세포에서 DMEM을 제거합니다.

이를 1회 XPBS로 헹군 다음, 발색 배지 1 mL를 첨가합니다. 이는 중탄산염이 포함되지 않고 pH 8로 조정된 RPMI 기반 배지입니다. 세포를 상온의 공기 중에서 37°C로 3일 동안 배양합니다.

이제 세포 내 Brady zos의 존재 여부를 분석할 준비가 되었습니다. Brady ZOS의 존재는 형광 표지된 렉틴 docos, 형광 글루테닌 또는 DBA를 사용하여 결정하며, 이는 Toxoplasma Gandhi의 시스트 벽에 결합합니다. 형광 이미징을 위해 감염된 세포를 준비하십시오. 1x PBS로 웰을 세 번 헹굽니다.

다음으로, 3% formaldehyde 200 µL를 사용하여 세포 단층을 20분 동안 고정합니다. 고정액을 제거하고 XPBS로 웰을 헹굽니다. 0.1 M glycine 200 µL를 웰에 넣고 5분 동안 방치합니다.

글라이신을 제거하고 웰을 XPBS로 한 번 헹구어 세포를 블록킹 및 투과화합니다. 블록킹 용액 250 µL를 첨가합니다. 세포를 30분 동안 배양합니다.

블로킹 용액을 제거하고 웰을 XPBS로 1회 헹굽니다. 루민(rumine)과 접합된 DBA를 1:250로 희석한 용액 50 µL를 웰에 첨가합니다. 플레이트를 덮고 플랫폼 셰이커를 이용하여 실온에서 1시간 동안 흔들어 줍니다.

배양 후, 플랫폼 쉐이커 위에서 0.2% Triton X 100이 포함된 1x PBS로 커버슬립을 5분씩 3회 세척하여 형광 표지된 DBA를 제거합니다. 마지막으로 dpi가 포함된 beta shield 마운팅 용액을 사용하여 커버슬립을 마운팅합니다. 염색된 결과는 rhodamine에 적합한 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 100배 배율로 관찰할 수 있습니다. Brady zo 형성을 유도하는 대체 방법으로, 인터페론 감마(interferon gamma)와 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide) 또는 LPS를 사용하여 감염된 골수 유래 대식세포를 활성화할 수 있습니다. 이를 위해 먼저 L 9 29 조건화 배지를 준비하십시오.

L 9 29은 장기간의 합류(confluency) 후 대식세포 콜로니 자극 인자를 분비하는 마우스 섬유육종 세포주입니다. 이 조건배지는 세포 배양 시 마우스 골수 세포를 대식세포로 분화시키는 데 사용될 수 있습니다. 조건배지를 준비하려면 L 9 2 9 세포를 150 cm² 플라스크에서 37 °C로 합류될 때까지 배양하십시오. 그 후, 세포가 구형으로 보이고 플라스크 표면에서 떨어지기 시작할 때까지 7~9일 동안 추가로 배양하십시오.

배지와 분리된 세포를 50 milliliter 튜브에 수집하고 420 5G에서 10분 동안 원심 분리합니다. 이렇게 얻은 상층액이 조건화 배지입니다. L 9 29 세포가 배양된 150 square centimeter 플라스크 한 개에서 30 milliliters의 조건화 배지를 얻을 수 있으며, 이는 150 milliliters의 BMC 배지를 조제하는 데 필요한 부피입니다. BMC 개발에 사용될 L 9 29 cm를 포함하여 BMC용 DMEM을 준비하십시오.

골수 세포 분리 방법을 설명하는 상세 비디오 프로토콜을 시청하십시오. 마우스 대퇴골의 경우, 수확한 BMC를 5일 동안 배양한 후 다음 비디오 프로토콜을 시청하시기 바랍니다. 세균학용 페트리 접시에 L 9 2 9 세포의 조건화 배지가 포함된 BMC 배지 10 milliliters를 각각 넣고 2일 더 배양하면 세포가 완전히 발달합니다.

성숙한 골수 유래 대식세포(BMS)는 성숙 후 1~2주 동안 계대 배양할 수 있습니다. BMS를 분할하기 위해 배지를 제거하고, 4°C에서 30분 동안 배양한 차가운 1xPBS 5mL를 첨가하여 세포가 떨어지기 시작할 때까지 기다립니다. 멸균된 전송 피펫을 사용하여 플레이트에서 세포를 헹궈냅니다. BMS를 50mL 코니컬 튜브에 옮기고 420×g에서 10분 동안 원심 분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.

펠렛을 10 milliliters의 BMC 배지로 재현탁한 다음, 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 세포 밀도를 결정합니다. 24웰 플레이트의 각 웰당 2 × 10⁵개의 BMC 세포를 분주합니다. 이때 플레이트 바닥에는 원형 블래스트 커버슬립이 놓여 있어야 하며, T. gondii를 감염시키기 전 세포가 하룻밤 동안 부착되도록 둡니다.

남은 세포는 나중에 사용하기 위해 페트리 접시(Petri dish)에 보관할 수 있습니다. BMS를 활성화하려면 활성화 배지를 준비하고, 응집물을 제거하기 위해 LPS를 항온수조에서 2분 동안 초음파 처리하십시오. 그 다음 BMC 배지에 100 ng/mL의 LPS와 100 U/mL의 IFN gamma를 첨가하십시오.

마지막으로, 웰에서 BMC 배지를 제거하고 활성화 배지로 교체합니다. 37°C, 5% CO₂ 조건에서 3일 동안 배양합니다. BMC는 이전에 포피 섬유아세포(foreskin fibroblasts)를 대상으로 보여준 것과 동일한 방법으로 염색할 수 있습니다.

이 예시들에서, 인간 포피 섬유아세포 내의 toxoplasma Gandhi I Bradys는 형광 DBA로 표지되었습니다. pH 스트레스 하에서, IFN Gamma와 L-P-S-D-V-A로 활성화된 dms 내의 인비트로(in vitro) 낭종의 이 단면에서 보는 바와 같이 낭종 벽이 형광 표지되었습니다.

여기에서 보는 바와 같이 액포 표면에서도 염색이 나타납니다. 지금까지 섬유아세포와 활성화된 대식세포 내의 in vitro Toxoplasma gondii 시스트를 염색하는 방법을 설명해 드렸습니다. 이 실험 절차를 수행할 때는 기생충과 호스트 세포가 같은 날에 준비될 수 있도록 계획하는 것이 중요합니다.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.