Name: Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: 배우세요 마우스 췌장에서 아일릿을 분리하고 신장 피막하 공간에 이식하는 방법을. 이 기술은 제1형 당뇨병 치료 연구와 이식 생물학 발전에 필수적입니다.

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<ol><li>Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+in+seven+patients+with+type+1+diabetes+mellitus+using+a+glucocorticoid-free+immunosuppressive+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.</a> N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+as+a+treatment+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Optom+Assoc%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation as a treatment for diabetes.</a> J Am Optom Assoc. 69, 727-732 (1998).</li>
<li>Gangemi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+transplantation+for+brittle+type+1+diabetes%3A+the+UIC+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Islet transplantation for brittle type 1 diabetes: the UIC protocol.</a> Am J Transplant. 8, 10-1111 (2008).</li>
<li>Zmuda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+ATF3%2C+an+adaptive-response+gene%2C+protects+islets+and+ameliorates+inflammation+in+a+syngenic+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Deficiency of ATF3, an adaptive-response gene, protects islets and ameliorates inflammation in a syngenic transplantation model.</a> Diabetologia. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bottino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Human+Islets+to+Isolation+Stress+and+the+Effect+of+Antioxidant+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Response of Human Islets to Isolation Stress and the Effect of Antioxidant Treatment.</a> Diabetes. 53, 2559-2568 (2004).</li>
<li>Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+islet+cell+culture+in+vitro+at+24+degrees+C+on+graft+survival+and+MHC+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The effect of islet cell culture in vitro at 24 degrees C on graft survival and MHC antigen expression.</a> Transplantation. 49, 272-277 (1990).</li>
<li>Terasaka, R., Lacy, P. E., Hauptfeld, V., Bucy, R. P., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cyclosporin-A%2C+low-temperature+culture%2C+and+anti-Ia+antibodies+on+prevention+of+rejection+of+rat+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The effect of cyclosporin-A, low-temperature culture, and anti-Ia antibodies on prevention of rejection of rat islet allografts.</a> Diabetes. 35, 83-88 (1986).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Sterbenz, K., Davie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+or+in+vivo+treatment+with+L3T4+antibody+produces+a+marked+prolongation+of+islet+human-to-mouse+xenograft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets or in vivo treatment with L3T4 antibody produces a marked prolongation of islet human-to-mouse xenograft survival.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 8080-8084 (1987).</li>
<li>Schnedl, W. J., Ferber, S., Johnson, J. H., Newgard, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STZ+transport+and+cytotoxicity.+Specific+enhancement+in+GLUT2-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">STZ transport and cytotoxicity. Specific enhancement in GLUT2-expressing cells.</a> Diabetes. 43, 1326-1333 (1994).</li>
<li>Eckhard, M., Brandhorst, D., Brandhorst, H., Brendel, M. D., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+in+osmolality+and+range+of+density+of+a+continuous+ficoll-sodium-diatrizoate+gradient+for+isopycnic+purification+of+isolated+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Optimization in osmolality and range of density of a continuous ficoll-sodium-diatrizoate gradient for isopycnic purification of isolated human islets.</a> Transplantation Proceedings. 36, 2849-2854 (2004).</li>
<li>Gores, P. F., Rabe, F., Sutherland, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+survival+of+intraportal+versus+subrenal+capsular+transplanted+islet+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prolonged survival of intraportal versus subrenal capsular transplanted islet allografts.</a> Transplantation. 43, 747-749 (1987).</li>
<li>Nasr, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+Immune+Privilege+Promotes+Transplantation+Tolerance+by+Altering+the+Balance+between+Memory+and+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Testicular Immune Privilege Promotes Transplantation Tolerance by Altering the Balance between Memory and Regulatory T Cells.</a> J Immunol. 174, 6161-6168 (2005).</li>
<li>Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+implantation+site+for+pancreatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation.</a> British Journal of Surgery. 95, 1449-1461 (2008).</li>
<li>Inoue, M., Maeno, T., Hatchell, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+allografted+pancreatic+islets+in+the+subretinal+space+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of allografted pancreatic islets in the subretinal space in rats.</a> Ophthalmic Res. 35, 48-53 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

위의 섹션에서, 우리는 마우스 췌장 아일 레츠를 분리하고 이식에 대한 자세한 단계를 설명했다. 여기서는 간략하게 절차의 성공을 위해 중요 단계를 강조 표시합니다. 1. 아일릿 절연 주요 단계는 37 후 일반적인 담즙 덕트 (2.3), 췌장의 힘차게 흔드는 걸 cannulating, 일반적인 담즙 덕트 (2.2.3)의 십이지장 개방을 통해 hemostat 클램프를 위치, 최적의 효소 소화 시간 (1.4) 식별 ° C 다이제스트 (3.2) 및 exocrine 세포 오염 (3.3.7 및 3.3.16)의 제거. 이 단계 아일 레츠의 품질, 수율과 순도에 극적인 영향을 미칠 수 있습니다. 아마 가장 기술적으로 어려운 단계는 일반적인 담즙 덕트의 cannulation입니다. 많은 생쥐에서 일반적인 담즙 덕트는 주변 근막에 의한 시각화하기 어려울 수 있습니다. 따라서, 그것은 시도는 근막 조직의 침투에있는 일반적인 담즙 덕트 결과를 cannulate에게 일반적입니다. 이러한 경우에는 Liberase는 주위 결합 조직을 채우기 시작과 췌장을 perfuse하지 않습니다. 이것이 관찰되면, Liberase의 흐름을 중지하고 담즙 덕트의 루멘으로 침투되도록 바늘을 조정. 연습을 통해 빨리 바늘 배치를위한 최적의 위치를​​ 파악하고 분쇄​​가 용이한 덕트를 손상하지 않고 cannulation을 완료 할 수 있습니다. 2. 아일릿 이식 중요한 단계는 당뇨병 (5.1)의 STZ 유도 및 subcapsular 파우치 (5.3.14-5.3.16)에 아일 레츠의 효율적인 전달됩니다. STZ은 인슐린 secreting 세포 아일 레츠 9 β - 세포에 선택적으로 독성 자연스럽게 발생 포도당 아날로그입니다. 그러나,이 선택적 독성은 상대적으로 좁은 농도 범위에서 발생합니다. 이것은 STZ의 다량으로 복용는 고혈당증의 부재에서 급속한 (2-3 일) 파괴 장면을 보여 주죠 초래할 수있다는 사실에 의해 입증됩니다. 따라서, 어떠한 대규모의 실험이 시작되기 전에 사용중인 마우스의 변형과 시대에 STZ 최적의 복용량을 식별할주의 주의해야한다. subcapsular 주머니에 아일 레츠의 실제 배달도 중요한 단계입니다. 일관된 결과를 달성하기 위해, 그것은 그들의 배달하는 동안 아일 레츠의 손실을 최소화하기 위해 필수적입니다. 주입 부피가 너무 큰 경우이 결함이나 주머니를 덮고있는 신장 캡슐에 눈물이 있거나 경우에 발생할 수 있습니다. 캡슐을 손상하고, subcapsular 주머니를 준비하는 부드러운 유리 프로브를 사용하여 온화하고 신중 조작에 의해 피할 수 있습니다. 또한, 사출 볼륨이 단계 5.3.6.3에서 뜨는주의 제거와 최소화할 수 있습니다. 뜨는이 sedimented 아일 레츠의 수준까지 제거하는 경우, 일반적으로 400-500 아일 레츠를 배치하는 subcapsular 주머니에 충분한 공간보다 더있다. 사출 볼륨이 너무 큰 경우에는, 아일 레츠는 실험의 재현성을 손상, 장기 이식 과정 주머니 밖으로 누출 가능성이 더 높습니다. 이 프로토콜 내에서이 단계의 일부를 수정하고 여전히 만족스러운 결과를 얻을 수 있습니다. 이들은 다음과 같습니다 (A) 췌장을 소화하기 위해 다른 효소의 사용, 췌장에 효소를 전달하기위한 (B) 다른 방법, (C) 연속 Ficoll - 나트륨 - diatrizoate (FSD) 그라디언트의 사용 대신 하나의 밀도 Histopaque1077 단계, 그리고 신장 subcapsule 이외의 위치 (D) 아일릿 이식니다. <ol class="lalpha"><li> 이 프로토콜에서는 Liberase는 췌장 내의 세포 세포 접촉을 약하게하는 데 사용됩니다. Liberase은 기본적으로 높은 췌장에서 아일 레츠를 방출에 유용 증명 collagenases을 정화의 혼합물이다. 그러나, 덜 정제된 collagenases는 비슷한 결과를 달성 할 수 있습니다. 따라서 한 소화 상태가 높은 아일릿 품질을 달성하기 위해 최적이므로, 수율과 순도, 췌장을 소화에 대해 다른 상용 효소 준비를 사용할 수 있습니다. </li><li> 그것은 효소의 ductal 재관류없이 췌장을 소화하는 것도 가능합니다. 일반적인 담즙 덕트를 통해 Liberase의 배송은 효소로 췌장 표면 영역의 최대한의 노출을 허용합니다. 췌장 및 손상 아일 레츠보다 릴리스보다 소화도이 결과를. 그러나 효소로 췌장의 표면 영역을 증가하기 위해 다른 단계를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Liberase에서 잠복기하거나 직접 췌장 캡슐을 통해 Liberase를 주입하기 전에 닦지 췌장은 아일 레츠를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, Liberase 전달의 다른 방법은 일반적인 담즙 덕트를 통해 재관류만큼 효과가 없다. 따라서, 닦지 또는 직접 분사는 일반적인 담즙 덕트가 손상 perfusable되지 않을 경우 최후의 수단으로 예약해야합니다. </li><li> exocrine 세포에서 아일 레츠 분리에 대한 다른 방법은 관련된Histopaque1077 10 대신 FSD 그라디언트 중 하나를 사용하십시오. 이 프로토콜의 exocrine 세포에서 아일 레츠의 효율적인 분리는 부분에 두 세포 유형 간의 밀도 차이에 의한 것입니다. Histopaque1077 25에서 1.0771 g / ML의 밀도 ° C. 있습니다 이 온도에서 Histopaque는 아일 레츠하지만 exocrine 세포보다 밀도보다 밀도이다. 따라서, 원심 분리, Histopaque1077 쥐똥 exocrine 세포의 힘 아래 표면에 아일 레츠 리프팅하는 동안. 원칙적으로, exocrine 세포에서 아일 레츠 분리 수있는 밀도 다른 물질이 단계에서 사용되며 FSD 그라디언트는 하나의 물질 수있다. </li><li> 아일 레츠 이식의 위치와 관련하여,이 프로토콜에서 사용되는 신장 캡슐은 몇 가지 사이트 중 하나입니다. 신장 subcapsule 생쥐에 이식 중 가장보고 사이트이지만 다른 이식 사이트는 효율적으로 발견하고 그들은 간장 포털 정맥, subretinal 공간, testis, epididymal 지방 패드, 비장, 심지어 췌장 11-14를 포함하고 있습니다. 이러한 각각의 위치는 자신의 장점과 도전을하고 있습니다. 따라서, 아일릿 이식에 대한 사이트의 선택은 해결 질문 및 실험 특정 상황에 의해 결정되어야합니다. </li></ol> 그것은 아일릿 이식의 한계를 극복 할 수 전략은 크게 그 치료 가능성을 향상시킬 것으로 생각됩니다. 따라서,이 프로토콜에 의해 세부로 murine 모델의 사용은 이러한 전략을 확인을위한 매력적인 접근법을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>시약</td><td>Roche Group</td><td>05401020001</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum)</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque1077</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>시트르산 나트륨(Sodium Citrate)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-0130</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>시약</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>시약</td><td>Vedco, Inc.</td><td>ISOSOL</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362574</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>27 Gauge 주사 바늘</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기 #1702</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>14813133</td><td></td></tr><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>6cm 페트리 접시</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>07770212</td><td></td></tr><tr><td>6-0 봉합사</td><td>장비</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8726H</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 유연 튜브</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9083963</td><td></td></tr><tr><td>5ml 일회용 주사기</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 튜브</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원추형 튜브</td><td>장비</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>0.1mm 나일론 메시</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>0.419mm 와이어 메시</td><td>장비</td><td>Newark Wire Cloth Company</td><td>0300241</td><td></td></tr><tr><td>항온 수조</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>장비</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>장비</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>장비</td><td>Napco</td><td>6300</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>장비</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14393</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 가위</td><td>장비</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500260</td><td></td></tr><tr><td>곡선 핀셋</td><td>장비</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td></td></tr><tr><td>지혈 핀셋</td><td>장비</td><td>Kent Scientific</td><td>INS 500451</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 네뷸라이저</td><td>장비</td><td>Smiths Medical</td><td>ISOTech 4 OHMEDA</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 원심분리기</td><td>장비</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>RT6000D</td><td></td></tr><tr><td>스윙 버킷 로터</td><td>장비</td><td>Dupont &amp;#8211; Sorvall</td><td>H1000B</td><td></td></tr><tr><td>pH 미터</td><td>장비</td><td>Mettler Toledo</td><td>09313509</td><td></td></tr><tr><td>겔 로딩 팁</td><td>장비</td><td>Fisher Scientific</td><td>05408151</td><td></td></tr><tr><td>p200 팁</td><td>장비</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

murine 아일릿 절연 및 subcapsular 신장 이식을위한 방법

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

당뇨병 설치류에 Langerhans의 아일 레츠의 이식을 입증 볼링거하고 Reckard의 초기 개척 작품들이 혈당 수치를 정상화 수 있으므로, 아일릿 이식은 1 형 당뇨병의 1,2에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 최근 인간의 아일릿 이식의 진보가 더 이상이보기 1,3를 강화했습니다. 그러나, 두 가지 주요 한계는 광범위한 임상 현실되는 아일릿 이식을 막기 : 크게 영향을 심각하게 잠재받는 사람 수를 줄여 환자 당 아일 레츠의 큰 숫자는 (a) 요구 사항, 그리고 무거운 immunosuppression에 대한 (B) 필요 장기 immunosuppression 자신의 취약점으로 인한 환자의 소아 인구. 이러한 한계를 극복 할 수 전략은 아일릿 이식의 치료 유틸리티를 향상시킬 가능성이있다. 마우스 신장 캡슐 아래 아일릿 이식은 아일릿 이식을 향상시키기 위해 다양한 전략을 조사하기 위해 널리 인정 모델입니다. 이 실험은 고품질 아일 레츠과 당뇨병 수신자에게 아일 레츠의 주입의 절연을 필요로합니다. 두 절차는 더 나은 텍스트보다 동영상으로 보여준 수있는 수술 단계가 필요합니다. 여기, 우리는 비디오 및 서면 프로토콜 모두 이러한 절차에 대한 자세한 단계를 문서화합니다. 우리는 또한 잠시 다른 이식 모델을 토론 : syngeneic, allogeneic, syngeneic 면역 및자가 면역 질환 allogeneic.

절연 아일 레츠의 이식은 제 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로 제안되었습니다. 여기 마우스 pancreata에서 아일 레츠를 분리하고 신장의 subcapsular 공간을 이식하는 방법을 설명합니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

당뇨병에 걸린 설치류에 랑게르한스섬을 이식하여 정상화할 수 있음을 입증한 Ballinger와 Reckard의 초기 선구적인 연구 이후...

췌도 이식은 1형 당뇨병의 잠재적 치료법으로 제안되어 왔습니다. 하지만 두 가지 주요한 한계점으로 인해 광범위한 임상적 적용이 어려운 실정입니다. 첫째, 수혜자당 다량의 췌도가 필요하다는 점입니다.섬-섬(eyelets)은 장기 기증자로부터 얻기 때문에 잠재적 수혜자의 수가 매우 제한적입니다. 2차 이식은 평생 강력한 면역억제제 치료가 필요하며, 이는 환자, 특히 소아 인구에게 악성 종양, 감염 및 신부전의 위험을 초래합니다. 임상적 이식 결과를 개선하기 위한 전략을 연구하기 위해 마우스 신장 캡슐 하 섬-섬 이식이 수행됩니다.건강한 공여 마우스에서 분리한 소도(eyelets)를 그룹별로 분류하여 이식 준비를 합니다. 그다음 소도를 신장의 피막하 공간에 이식합니다. 당뇨병 수 recipient 마우스에서 소도 이식편의 기능을 혈당 수치 모니터링을 통해 평가하며, 이를 통해 약 250~350개의 소도를 이식하면 20 g의 수 recipient 마우스에서 이식 후 24시간 이내에 혈당 수치가 정상으로 회복됨을 확인할 수 있습니다.캐뉼라 삽입 단계에 있어 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다. 총담관의 캐뉼라 삽입과 신장 피막 하 공간으로의 아이렛(eyelet) 전이는 습득하기 어렵습니다. 이러한 단계에서는 조직 구조의 식별, 정교한 손놀림, 그리고 조직 손상을 최소화하는 기술의 사용이 요구됩니다.안락사시킨 마우스를 해부 현미경 아래의 종이 타월 위에 배를 하늘로 향하게 하여 눕히고, 복부에 70% ethanol을 분사합니다. 가위를 사용하여 치골 부위에서 양쪽 앞다리 방향으로 V자형 절개를 하여 복부를 엽니다. 마우스가 해부 현미경 아래에 위치해 있습니다.머리가 관찰자를 향하도록 배치합니다. 지혈鉗子(hemostat clamp)를 사용하여 총담관의 십이지장 유입구, 즉 총담관의 십이지장 개구부를 찾습니다. 지혈鉗子는 압착했을 때 췌장-장 경계를 따라 정확하게 위치하도록 배치해야 합니다.담관을 캐뉼레이션하는 두 가지 방법을 시연하겠습니다. 담관 캐뉼레이션을 위한 프리핸드법(free hand method)과 포셉 보조법(forceps assist method)입니다. 프리핸드법을 사용할 때는 십이지장에 고정된 지혈 겸자를 쥐의 머리에서 꼬리 방향으로 당겨 총담관이 팽팽해지도록 합니다.담낭에서 배출되는 담즙과 간에서 분비되는 효소가 합쳐지는 간 근처의 담관 합류 지점이 있습니다. 장으로 들어가기 전, 담관을 팽팽하게 당겨 V자 모양의 안쪽 위치를 노출시킵니다. 5 mL 주사기에 연결된 굽은 27 gauge 바늘을 사용하여 바늘이 V자 부분을 그대로 통과하게 하여 담관의 하단을 직접 캐뉼라합니다. 간과 담낭으로 역류하는 것을 방지하기 위해 바늘을 베벨 끝보다 수 밀리미터 더 깊게 삽입하십시오.캐뉼라 삽입에 성공하면, 주사기로 liase 2 mL를 투여하여 췌장을 관류합니다. 최적의 캐뉼라 삽입 여부를 확인하기 위해 췌장이 위 위쪽으로 팽창하는지 관찰하십시오. 또는 담관에 캐뉼라를 삽입할 수도 있습니다.포셉 낭(forceps cyst) 방법을 사용합니다. 십이지장에 고정된 지혈집게 C를 생쥐의 머리 반대 방향인 꼬리 쪽으로 당겨 총담관이 팽팽해지게 합니다. 그런 다음 5 mL 주사기에 연결된 굽은 27 gauge 바늘을 사용하여 간 근처의 총담관 아래쪽 근막을 천자합니다.바늘을 그대로 둔 상태에서 바늘을 사용하여 관에서 근막을 제거합니다. 지혈鉗(hemostat)를 내려놓고 핀셋을 집어 듭니다. 벌려진 핀셋의 한쪽 팔을 사용하여 바늘로 근막을 제거한 담관 부위를 지지하면서, 담관과 핀셋을 앞으로 당깁니다.포셉을 지지대로 사용하여 바늘을 도관 속으로 밀어 넣습니다. 성공적으로 캐뉼레이션(cannulation)이 되면 위 상단의 췌장 부위가 고르게 팽창합니다. 췌장에 관류가 이루어지면 십이지장에서 지혈鉗(hemostat)을 제거합니다.그 다음 핀셋을 사용하여 십이지장을 들어 올리고, 두 번째 핀셋을 사용하여 췌장을 장에서 분리합니다. 이어서 췌장을 위의 상단과 비장에서 떼어냅니다. 마지막으로 췌장을 복부 밖으로 들어 올린 후, 장, 위, 비장에 연결된 나머지 근막 연결 부위를 절단하여 완전히 분리합니다.췌장을 50 mL 원뿔형 튜브에 넣고 얼음 위에 둡니다. 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 췌장을 37 °C에서 배양합니다. 배양 후, 튜브에 배지 20 mL를 추가하고 10초 동안 40회 강하게 흔들어 조직을 분리합니다.이 단계는 바이올렛의 최적 회수를 위해 매우 중요합니다. 세포를 800 rpm으로 원심분리하십시오. 부유물을 15 mL의 배지에 재현탁하고 샘플을 농축하십시오.재현탁된 슬러리를 0.419 millimeter 와이어 메시로 걸러 새로운 50 milliliter 원심분리관에 넣습니다. 첫 번째 튜브를 10%fetal bovine serum이 함유된 배지 10 milliliters로 헹구어 와이어 메시를 통해 함께 붓습니다. 원심분리를 통해 세포를 펠렛화합니다. 상온의 histopaque 1077 5 milliliters로 펠렛을 재현탁합니다. 그런 다음 수 초 동안 가볍게 볼텍싱합니다. histopaque 5 milliliters를 추가로 넣고 튜브 내벽을 따라 돌려 벽면에 붙은 세포들을 씻어냅니다. serum free RPMI 10 milliliters를 튜브 벽면을 따라 10초당 1 milliliter의 속도로 천천히 피펫팅하여 층을 형성합니다.뚜렷한 경계면이 관찰되어야 합니다. 그다음, 스윙 버킷 원심분리기를 사용하여 20 °C에서 900 ×g로 20분 동안 원심분리하되, 가속도는 매우 낮게 설정하고 제동은 걸지 마십시오. 원심분리 후, 일회용 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 췌도(islets)를 외분비 세포로부터 분리합니다. HistoPaque 배지 경계면에서 췌도를 새로운 50 mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.이 단계에서 여러 개의 튜브를 모아 잔류 islet을 제거할 수 있으며, 혈청 함유 배지로 불투명한 튜브를 채운 후 800 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 islet을 펠릿화합니다. 그 다음, islet을 신선한 배지에 다시 현탁합니다. 이 단계를 최소 2회 반복합니다.펠렛을 5 mL의 배지에 현탁합니다. 15 mL 원추형 튜브 위에 0.1 mm 나일론 세포 스트레이너를 뒤집어서 배치합니다. 현탁된 세포 슬러리를 피펫으로 스트레이너에 통과시켜 아이렛(eyelets)을 수집합니다.그런 다음 50 mL 튜브를 배지 6 mL로 추가 헹구고 거름망(strainer)에 통과시킵니다. 10 cm 페트리 접시에 배지 3 mL를 한 방울 떨어뜨립니다. 셀 거름망을 뒤집어 배지 방울에 담가 아이렛(eyelets)을 수집하고, 5~7 mL의 배양액을 추가로 피펫팅하여 거름망을 통해 페트리 접시에 넣습니다.4배 대물렌즈 하에서 스트레이너에 남아 있는 안구 입자를 수집하려면, P 200 피펫으로 안구 입자를 개별적으로 채취하여 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이 이미지들은 12주령 C 57 black six 마우스에서 분리한 안구 입자를 보여줍니다. 분리 절차가 완료된 후 현미경을 통해 안구 입자의 순도와 품질을 추정할 수 있습니다.예를 들어, 여기에 제시된 두 이미지는 잔해물과 외분비 세포 오염이 존재하는 대표적인 시야를 보여줍니다. 실험을 위해 아이렛(eyelet)을 선택할 때, 오염된 외분비 세포나 상태가 좋지 않아 보이는 아이렛은 피하십시오. 분리 24시간 후 촬영한 이 그림에서 볼 수 있듯이 중심부가 괴사된 아이렛은 건강하지 않은 상태이며, 괴사된 중심부는 분리 직후에는 보이지 않습니다.세포가 탈락하는 아일렛(eyelet)은 불가피하며, 아일렛의 24시간 타임랩스 영상에서 볼 수 있듯이 아일렛 이식에 사용될 수 있습니다. 분리 직후, 많은 아일렛 내부에 괴사 중심부(necrotic centers)가 형성됩니다. 아일렛을 선택하는 과정 중 녹화 마지막 단계에서 이러한 괴사 중심부가 아일렛 밖으로 배출되는 것으로 보입니다.각 튜브에 아일렛의 품질과 크기가 균등하게 분포되도록 그룹화합니다. 예를 들어, 15개의 아일렛으로 구성된 각 그룹에는 대형 아일렛 4개, 중형 아일렛 6개, 소형 아일렛 5개가 포함될 수 있습니다. 튜브를 얼음에 둡니다. 아일렛은 즉시 이식에 사용하거나 조작할 수 있습니다.사용 전, 멸균된 젤 로딩 팁을 1.5 mL 마이크로 튜브의 입구에 넣어 팁의 좁은 끝부분이 U자형으로 완만하게 구부러지도록 합니다. 팁의 양쪽 끝이 모두 마이크로 튜브 밖을 향해 위로 똑바로 향해 있어야 합니다.얼음에서 아이렛(eyelet) 튜브를 조심스럽게 꺼냅니다. 모든 아이렛이 튜브 바닥에 가라앉았는지 확인하십시오. P 200 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 최소량의 부피로 아이렛을 조심스럽게 수집한 후, 준비된 곡선형 팁(curved tip)으로 옮깁니다.아이렛(islet)이 가라앉은 후, 아이렛이 담긴 젤 로딩 팁의 넓은 개구부를 통해 배지를 흡입하여 팁 끝에서 배지를 최대한 제거합니다. P 200 피펫에 새 젤 로딩 팁을 장착하십시오. 튜브의 비경사단(non beveled end)을 아이렛이 담긴 젤 로딩 팁의 좁은 개구부에 연결합니다. 그런 다음 팁을 P 200 피펫에 장착하고 아이렛을 튜브 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다.다음으로, PE 50 튜브의 비스듬하지 않은 끝단을 25 µL Hamilton 시린지의 바늘에 연결합니다. 플런저를 당긴 상태에서 시린지의 플런저를 눌러 아이렛(eyelets)이 비스듬한 개구부로부터 약 0.5 cm 거리까지 오도록 합니다. 신장을 아이렛 수용 준비 시키는 동안, 아이렛이 튜브의 비스듬한 개구부 근처에서 하나의 덩어리로 모여 안정될 수 있도록 시린지를 옆으로 놓아둡니다.털을 깎고 Betadine과 70% isopropyl alcohol을 교대로 세 번 사용하여 피부를 세척하여 수술 부위를 준비합니다. 수혜 마우스의 발가락 집기(toe pinch)를 통해 마취 상태를 확인하여 아이렛 이식 절차를 시작합니다. 유리 막대의 축을 마우스 바로 아래, 신장 하단에 척수와 수직이 되도록 배치합니다.그런 다음 피부를 통해 신장의 위치를 확인하고 멸균 수술포를 덮습니다. 신장 위치가 확인되면 McFerson banis 가위를 사용하여 신장 바로 위의 진피층에 척수와 수직이 되도록 2cm 길이로 절개합니다. 이 절개를 통해 가위로 복벽을 노출시킵니다.유리 막대의 샤프트를 받침대로 사용하여 피부층을 절개한 방향과 동일하게 복막벽을 1cm 절개합니다. 인접한 표면을 눌러 복막 개구부를 통해 신장이 밀려 나오게 합니다. 적신 면봉을 사용하여 노출된 신장 표면을 얼음처럼 차가운 멸균 PBS로 적셔줍니다. 신장 캡슐이 건조해지는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 몇 분마다 이 단계를 반복합니다.27게이지 바늘을 사용하여 신장 캡슐의 전면을 가로질러 0.2cm 절개를 만듭니다. 좌측 외측에서 우측 외측 방향으로 화염 연신 유리 모세관을 삽입합니다. 앞서 만든 절개 부위를 통해 탐침하고, 신장의 배측 외측면을 따라 후방 방향으로 이동시킵니다.신장 캡슐과 신장 실질 사이에 파우치를 만들기 위해, 준비된 25 milliliter Hamilton 주사기의 아이렛을 유연한 튜브의 비스듬한 개구부 가장자리까지 이동시킵니다. 그런 다음 비스듬한 모서리가 위를 향하도록 하여 캡슐 하부 파우치에 삽입합니다. 이때 긴 모서리가 신장 실질과 접촉하게 됩니다.튜브를 캡슐의 가장 후방 끝으로 이동시킵니다. 그런 다음 시린지의 플런저를 눌러 PE 50 튜브에 들어있는 아이렛(eyelets)을 캡슐 하부 포켓(subcapsular pouch)으로 천천히 옮깁니다. 아이렛이 포켓을 채우면, 더 많은 공간을 확보하기 위해 유연한 튜브를 천천히 뒤로 뺍니다.튜브를 파우치에서 제거한 후, 유리 프로브를 신장 표면을 따라 앞쪽에서 뒤쪽으로 밀어 아이렛(eyelet)을 파우치의 근위단으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 굴곡형 포셉(bent arm forceps)을 사용하여 신장을 위해 만들어진 개구부 주변의 복막 내벽을 들어 올립니다. 그런 다음 PBS에 적신 면봉을 사용하여 신장을 복강 안으로 부드럽게 다시 밀어 넣습니다.복벽에는 봉합사를 사용하고 진피층에는 상처 클립을 사용하여 마우스의 절개 부위를 폐쇄합니다. 마우스를 케이지로 돌려보내고 상태를 모니터링합니다. 회복을 위해 마우스의 장 건강을 돕는 아세토메인 수(aceto meine water)를 제공해야 합니다.C 마우스 안구 조직을 분리했습니다. 이 비디오에서 설명한 방법을 사용하여 치료 용량을 동종 C 57 black six 마우스에 이식했습니다. 수술 후 1일째부터 공복이 아닌 상태의 혈당 수치를 모니터링했습니다.동종 공여체로부터 300개의 안구 조직(eyelets)을 이식받은 20g의 수혜 쥐에서는 약 17일경에 거부 반응이 나타납니다. 동종 공여체로부터 150개 또는 300개의 안구 조직을 이식받은 쥐들을 대상으로 회복 상태를 관찰하였습니다. 이들 이식에서는 안구 조직이 동종 공여체로부터 유래되었으므로 거부 반응이 나타나지 않습니다.투여된 islet 용량은 이식 직후 islet의 주요 기능을 측정합니다. 150개의 islet을 이식했을 때는 부분적인 회복이 관찰된 반면, 300개의 islet을 이식했을 때는 완전한 회복이 관찰되었습니다. 이 영상을 시청한 후, 마우스 islet을 분리하고 이를 신장 피막하 공간에 이식하는 데 필요한 핵심 단계들을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.연습을 통해 이 프로토콜에서 가장 어려운 단계인 총담관 캐뉼라 삽입을 빠르게 수행하는 능력을 기를 수 있을 것입니다.

a-method-for-murine-islet-isolation-subcapsular-kidney

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리 프로토콜이 정상적으로 쉽게 생쥐의 신장에 따라 캡슐 아일 레츠이나 세포를 제공하기 위해 개발되었습니다. 세포 신장 캡슐에서 세포를 이식에 사용되는 최종 튜브에 쥐똥에 집중되어있다. 이 기법의 용이성은 세포와 마우스에 스트레스를 줄여줍니다.

당뇨병 마우스의 신장 캡슐으로 췌장 아일 레츠의 이식

생쥐의 신장 이식은 성공을위한주의 이후 수술 진료와 치료를 필요로하는 기술적으로 도전적인 절차입니다.

Murine 신장 이식 절차

이 비디오에서는 췌장섬 세포를 간 문맥에 주입한 다음 출혈을 성공적으로 방지하기 위해 젤 폼을 적용하는 절차를 설명합니다. 수술 후 출혈은 섬 이식 중 높은 사망률의 흔한 원인입니다.

섬 이식의 쥐 모델: 췌장도를 문맥에 주입하는 수술 방법 및 수술 후 출혈 예방

안구 이식 및 공 촛점 현미경을 결합 새로운 접근 방식은 이식 조직 내에서 단일 셀 해상도 세로, 비 침습적 실시간 이미징을...

길이, 비 침습적을위한 안구의 앞쪽 상공 회의소에 이식<em&gt; 생체에</em실시간으로 단일 셀 해상도&gt; 영상

이 원고의 목표는 동맥 문합에 대한 세부 사항에 특히 주의를 기울여 마우스에서 신장 이식을 수행하는 데 필요한 단계를 설명하는 것입니다.

쥐 신장 이식 기술

이 프로토콜은 murine islet isolation과 decellularized scaffold상의 seeding을 증명합니다. Scaffold-supported 랑게질을 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 생쥐의 부고환 지방 패드에 이식 하였다. 아일 레트는 이식 부위에서 생존하고 고혈당 상태를 역전시켰다.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

마우스에 독도의 omental 이식 하는 방법을 소개 합니다. 격리 된 독도 히드로와 혼합 하 고 혼합 당뇨 마우스의 omental 주머니에 배치 됩니다. 그리고, 혈액 포도 당 감시 면역 조직화 학적인 분석을 수행 합니다.

마우스에 Omentum 작은 섬 이식 하는 방법

췌 장 섬 이식 타입-1 당뇨병에 normoglycemia를 달성 하는 방법입니다. 이 문서는 당뇨병 쥐의 정상적인 포도 당 수준을 유지 하는 intraportal 경로 통해 이식 기술에 초점을 맞추고.

Intraportal 이식 마우스 모델에서 췌 장 독도의

우리는 2'-데옥시구아노신 처리 된 E18.5 흉선을 누드 마우스의 신장 캡슐로 이식하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이 방법은 흉선 상피 세포 기능과 T 세포 성숙 의 연구에서 보좌관해야한다.

누드 마우스에서 2'-Deoxyguanosine 처리 된 뮤린 배아 흉골의 신장 탈모 이식

이 프로토콜에서, 뮤린 아일렛 분리 및 인추니얼 피하 백색 지방 조직내로이식하는 방법이 기재되어 있다. 분리된 합성 뮤린 섬은 지하 막 하이드로겔을 사용하여 뮤린 수용자로 이식된다. 수령인의 혈당 수준을 모니터링하고, 아일렛 이식의 학력 분석이 수행됩니다.

뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

우리는 인간 줄기세포에서 유래한 췌장 줄기세포 섬을 면역결핍 쥐에 근육 내 이식하여 생체 내 이식과 후속 분석을 위한 최소 침습 프로토콜을 제공합니다.

쥐에서 인간 다능성 줄기세포 유래 췌장 내분비세포의 근육 내 이식

배우세요 마우스 췌장에서 아일릿을 분리하고 신장 피막하 공간에 이식하는 방법을. 이 기술은 제1형 당뇨병 치료 연구와 이식 생물학 발전에 필수적입니다.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

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