Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

작은 구멍 이식은 제1형 당뇨병의 잠재적인 치료법으로 제안되었습니다. 그러나 두 가지 주요 제한 사항으로 인해 광범위한 임상 현실이 되지 못하고 있습니다. 첫째, 수혜자당 많은 수의 구멍이 필요합니다.

구멍은 장기 기증자로부터 얻기 때문에 잠재적 수혜자의 수는 심각하게 제한됩니다. 두 번째 이식은 강력한 면역억제제로 평생 치료를 받아야 하며, 이로 인해 환자, 특히 소아 환자는 악성 종양, 감염 및 신부전의 위험에 처하게 됩니다. 임상 이식 결과를 개선하기 위한 전략을 조사하기 위해 마우스 신장 캡슐 아래에 작은 구멍을 이식하는 것이 수행됩니다.

건강한 기증자 마우스에서 분리한 작은 구멍을 그룹으로 분류하고 이식 준비를 했습니다. 그런 다음 구멍을 신장의 수정막하 공간으로 이식합니다. 당뇨병 수혜자 마우스에서 작은 구멍 이식 기능은 혈당 수치를 모니터링하여 평가되며, 이는 약 250-350개의 구멍이 이식 후 24시간 이내에 20g 수혜자 마우스에서 u 혈당을 회복하는 것으로 나타났습니다.

이 방법의 시각적 시연은 캐뉼레이션 단계와 관련하여 중요합니다. 총담관과 구멍이 신장의 피막하 공간으로 이동하는 것은 배우기 어렵습니다. 이러한 단계를 수행하려면 조직 구조를 식별하고, 손을 안정시키고, 조직 손상을 최소화하는 기술을 사용해야 합니다.

안락사된 쥐를 누운 자세로 해부 내시경에 종이 타월을 깔고 복부에 70% 에탄올을 뿌립니다. 가위를 사용하여 치부에서 양쪽 앞다리까지 V자로 절개하여 복부를 엽니다. 마우스가 해부 범위 아래에 있습니다.

머리가 관찰자를 향하도록 배치합니다. 총담관의 십이지장 입구를 지혈 클램프, 즉 총담관의 십이지장 개구부로 찾습니다. 지혈제는 압축될 때 췌장 경계 를 따라 정확하게 흐르도록 위치해야 합니다.

여기에서는 담관을 캐뉼레이션하는 두 가지 방법을 보여줍니다. 자유손 방법과 겸자 보조 방법은 담관을 캐뉼레이션하는 방법입니다. 자유손 방법을 사용하여 십이지장에 고정된 지혈제를 마우스의 머리에서 꼬리 쪽으로 당겨 총담관이 팽팽하게 되도록 합니다.

간에 가까운 담관에는 담낭에서 배출되는 담즙과 간의 효소가 만나는 합류점이 있어 장에 들어가기 전에 담관을 꽉 당겨 V자 자세 내부가 드러나도록 합니다. 5밀리리터 주사기에 부착된 구부러진 27게이지 바늘을 바늘이 V를 통해 바로 미끄러져 덕트의 아래쪽 부분을 직접 캐뉼링하도록 합니다. 바늘을 베벨 끝에서 몇 밀리미터 너머로 밀어 간과 담낭으로 역류하는 것을 방지합니다.

캐뉼레이션이 성공적이면 주사기에서 2ml의 리아제를 분배하여 췌장을 관류합니다. 췌장이 위 위로 확장되는 것을 관찰하여 최적의 삽관을 관찰하십시오. 또는 담관을 캐뉼레이션할 수 있습니다.

겸자 낭종 방법을 사용합니다. 십이지장에 고정된 지혈 C를 마우스의 머리에서 꼬리 쪽으로 당겨 총담관이 불법 복제가 되도록 합니다. 그런 다음 5밀리리터 주사기에 부착된 구부러진 27게이지 바늘을 사용하여 간에 가까운 총담관 아래의 근막을 뚫습니다.

바늘을 사용하여 바늘이 제자리에 있는 상태에서 덕트에서 근막을 제거합니다. 지혈제를 내려놓고 집게를 듭니다. 열린 집게의 한쪽 팔을 사용하여 바늘이 근막을 제거한 담관을 지지하면서 관과 집게를 앞으로 당깁니다.

집게를 백스톱으로 사용하여 바늘을 덕트에 밀어 넣습니다. 성공적인 캐뉼레이션은 위 상단의 췌장 영역이 고르게 확장되는 것으로 표시됩니다. 췌장이 관류되면 십이지장에서 지혈을 제거합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 십이지장을 들어 올리고 두 번째 집게를 사용하여 췌장을 장에서 분리합니다. 다음으로, 위와 비장 위쪽에서 췌장을 빼냅니다. 마지막으로 복부에서 췌장을 들어 올려 장, 위 및 비장에 대한 나머지 근막 연결을 잘라냅니다.

췌장을 50ml 원뿔형 튜브에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 췌장을 섭씨 37도에서 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 배양합니다. 배양 후 튜브에 20ml의 배지를 추가하고 10초 동안 튜브를 40회 격렬하게 흔들어 조직을 해리합니다.

이 단계는 제비꽃의 최적 회복을 위해 중요합니다. 스핀 셀은 분당 800회 회전합니다. Resus는 15ml의 배지를 소비하고 샘플을 응축합니다.

0.419mm 철망을 통해 재현 유 슬러리를 붓고 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에 넣습니다. 10%fetal 둔감한 혈청을 포함하는 매체의 추가 10 밀리리터를 가진 첫번째 관을 헹구고 철망사를 통해서 그것을 따르고, 분리기 reus에 의하여 세포를 펠릿 펠릿, 그의 불투명한 10 77의 실내 온도의 5 밀리리터에 있는 펠릿 구부리십시오. 그런 다음 몇 초 동안 부드럽게 소용돌이치고, 튜브 내부에 불투명 한 5 밀리리터를 추가하여 튜브 벽의 구멍을 천천히 피펫으로 씻어 10 초당 1 밀리리터의 비율로 튜브 측면에 10 밀리리터의 혈청없는 RPMI를 오버레이합니다.

날카로운 인터페이스가 분명해야 합니다. 그런 다음 섭씨 20도, 중력의 900배에서 20분 동안 매우 느린 가속과 원심분리 후 제동 없이 스윙 버킷 원심분리기에서 샘플을 회전시키면 일회용 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 섬이 외분비 세포에서 분리됩니다. histo Paque 미디어 인터페이스에서 새로운 50ml 원추형 튜브로 구멍을 옮깁니다.

이 시점에서 여러 개의 튜브를 모아 잔여물을 제거하고, 불투명한 튜브를 혈청이 포함된 매체로 채우고, 튜브를 분당 800회 회전으로 2분 동안 원심분리하여 섬을 펠릿화할 수 있습니다. 그런 다음 reus는 새로운 매체에 섬을 매달아 놓습니다. 이 단계를 두 번 이상 반복합니다. 레우스.

팔레트를 5밀리리터의 미디어에 매달아 놓습니다. 0.1mm 나일론 셀 스트레이너를 15ml 원뿔형 튜브에 거꾸로 놓습니다. 재부유 세포를 피펫으로 주입하여 구멍을 모으기 위해 슬러리를 통과합니다.

그런 다음 50ml 튜브에 6ml의 매체를 추가로 헹구고 여과기에 통과시킵니다. 10cm 페트리 접시에 미디엄 3ml 방울을 떨어뜨립니다. 세포 스트레이너를 뒤집어 미디어 드롭에 담그고 구멍을 피펫으로 모으고 스트레이너를 통해 추가로 5-7ml의 배양 배지를 페트리 접시에 넣습니다.

4회 대물렌즈 아래의 스트레이너에서 남은 구멍을 수집하려면 P 200 피펫으로 구멍을 개별적으로 선택하고 1.5ml 마이크로 퍼지 튜브로 옮깁니다. 이 이미지는 12주 된 C 57 검은색 6마리 생쥐에서 분리된 구멍을 보여줍니다. 구멍의 순도와 품질은 분리 절차 완료 시 현미경으로 추정할 수 있습니다.

예를 들어, 여기에 표시된 두 이미지는 파편과 외분비 세포 오염이 존재하는 대표적인 필드를 보여줍니다. 실험을 위해 구멍을 선택할 때 건강에 해로워 보이는 오염된 외분비 세포나 구멍을 선택하지 마십시오. 괴사 중심이 있는 작은 구멍은 격리 후 24시간 후에 촬영한 이 그림에서 볼 수 있듯이 건강에 해롭고, 괴사 중심은 격리 직후 보이지 않습니다.

세포를 벗겨내는 작은 구멍은 피할 수 없으며 이 작은 구멍의 24시간 타임랩스 비디오에서 작은 구멍 이식에 사용할 수 있습니다. 격리 직후, 괴사 중추는 많은 구멍 내에서 발생합니다. 이 괴사 중심은 구멍을 따는 동안 녹음이 끝날 무렵 구멍에서 배출되는 것으로 보입니다.

각 튜브가 구멍 품질과 크기가 균일하게 분포되도록 그룹화합니다. 예를 들어, 15개의 구멍으로 구성된 각 그룹에는 4개의 큰 구멍, 6개의 중간 구멍 및 5개의 작은 구멍이 포함될 수 있습니다. 장소. 얼음 구멍에 있는 튜브는 이식에 즉시 사용하거나 조작할 수 있습니다.

사용하기 전에. 멸균 젤 로딩 팁을 1.5ml 마이크로 퓨즈 튜브의 개구부에 넣어 팁의 좁은 끝 부분에 U자형을 만드는 완만한 구부러짐이 있도록 합니다. 팁의 두 구멍은 마이크로 쓰레기 튜브 바깥쪽을 직접 향해야 합니다.

얼음에서 구멍 튜브를 부드럽게 제거합니다. 모든 구멍이 튜브 바닥에 가라앉았는지 확인합니다. P 200 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 최소한의 부피로 구멍을 부드럽게 모아 준비된 곡선 팁으로 옮깁니다.

구멍이 침전된 후, P 200 피펫에 부착된 새 겔 로딩 팁을 사용하여 겔 로딩 팁이 있는 아일릿의 큰 구멍을 통해 미디어(Media)를 흡인하여 팁에서 가능한 한 많은 미디어(Media)를 제거합니다. 튜빙의 비스듬하지 않은 끝을 젤 로딩 팁이 있는 섬의 좁은 구멍에 부착합니다. 그런 다음 팁을 P 200 피펫에 부착하고 섬을 튜빙에 부드럽게 밀어 넣습니다.

그런 다음 PE 50 튜빙의 비스듬하지 않은 가장자리를 25마이크로리터 해밀턴 주사기의 바늘에 연결합니다. 플런저를 빼서 구멍이 비스듬한 개구부에서 약 0.5cm 떨어질 때까지 주사기의 플런저를 누릅니다. 신장이 구멍을 받을 준비를 하는 동안 구멍이 튜브의 비스듬한 입구 근처에서 단일 덩어리로 정착할 수 있도록 주사기를 따로 보관하십시오.

베타딘과 70% 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 3회 바르며 머리카락을 자르고 피부를 문질러 수술 부위를 준비합니다. 투입구 핀치를 수행하여 이식 마우스의 마취를 확인하여 구멍 이식 절차를 시작합니다. 유리 막대의 축을 마우스 바로 아래와 척수에 수직인 신장 아래에 놓습니다.

그런 다음 피부를 통해 신장을 찾고 멸균 수술용 드레이프를 놓습니다. 신장의 위치를 찾으면 McFerson 바니스 가위를 사용하여 척수에 수직으로 바로 위의 진피를 통해 2cm를 절개합니다. 이 절개는 가위로 복막벽을 노출시킵니다.

유리 막대의 샤프트를 백스톱으로 사용하여 진피층을 절단하는 것과 같은 방향으로 복막벽을 통해 1cm 절개를 만들고 인접한 표면을 눌러 복막 개구부를 통해 신장을 밀어 넣습니다. 노출된 신장 표면을 물에 적신 면 팁 어플리케이터를 사용하여 얼음처럼 차갑고 멸균된 PBS로 적십니다. 신장 캡슐이 건조해지는 것을 방지하기 위해 필요에 따라 몇 분마다 단계를 반복하십시오.

27 게이지 바늘을 사용하여 신장 캡슐을 통해 신장 전방 표면을 가로질러 0.2cm를 절개합니다. 왼쪽 측면에서 오른쪽 측면으로 이동하여 화염 당김 유리 모세관 튜브를 삽입합니다. 앞서 절개한 부위를 자세히 살펴보고 신장의 등쪽 측면 표면을 따라 뒤쪽 방향으로 움직입니다.

신장 캡슐과 신장 실질 사이에 주머니를 만들려면 준비된 25ml Hamilton 주사기의 구멍을 유연한 튜브의 비스듬한 입구 가장자리로 이동합니다. 그런 다음 비스듬한 가장자리가 위를 향하도록 하여 수정막하 주머니에 삽입합니다. 긴 가장자리는 신장 실질과 접촉합니다.

튜브를 캡슐의 가장 뒤쪽 끝으로 이동합니다. 그런 다음 주사기의 플런저를 눌러 PE 50 튜브의 구멍을 수정막하 파우치로 천천히 옮깁니다. 구멍이 파우치를 채우면 유연한 튜브를 천천히 뒤로 밀어 더 많은 공간을 확보합니다.

파우치에서 튜브를 제거한 후 유리 프로브를 신장 앞쪽의 바깥쪽 표면을 따라 뒤쪽으로 밀어 구멍을 파우치의 근위부 끝에 부드럽게 넣습니다. 구부러진 팔 집게를 사용하여 신장을 위해 만들어진 구멍에 인접한 복막 내벽을 들어 올립니다. 그런 다음 PBS에 적신 면 팁 어플리케이터를 사용하여 신장을 복막강 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다.

복막벽에 봉합사를 바르고 진피층에 상처 클립을 도포하여 마우스를 닫습니다. 마우스를 케이지와 모니터로 되돌립니다. 회복을 위해 쥐의 장에 아세토 마이네 물을 제공해야 합니다.

C 마우스 구멍이 분리되어 있습니다. 이 비디오에 설명된 방법과 치료 용량을 사용하여 동종 C 57 블랙 6 마우스에 이식했습니다. 공복 상태가 아닌 혈당 수치는 수술 후 첫날부터 모니터링되었습니다.

거부 반응은 동종 기증자로부터 300개의 구멍을 받은 20g 수혜자 마우스에서 17일경에 볼 수 있습니다. 회복은 공생적 기증자로부터 150개의 구멍 또는 300개의 구멍을 받은 마우스에서 모니터링되었습니다. 이 이식에서는 구멍이 syngeneic donors로부터 나오기 때문에 거부 반응이 보이지 않습니다.

투여된 작은 구멍 용량은 이식 직후 작은 구멍의 주요 기능을 측정합니다. 150개의 구멍에서 한계 회복이 관찰된 반면, 300개의 구멍을 이식했을 때 완전한 회복이 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스 구멍을 분리하고 해당 구멍을 신장의 캡슐하 공간 아래에 이식하는 데 필요한 중요한 단계를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

연습을 통해 이 프로토콜에서 가장 어려운 단계인 총담관을 빠르게 캐뉼레이션할 수 있는 능력을 개발할 수 있습니다.