siRNA 역형질주입 기반 유전자 침묵 In vitro: 표적 유전자 발현을 비활성화하기 위해 배양된 세포에 작은 간섭 RNA를 전달하는 절차

혼합할 수 있는 개선된 최소 필수 배지로 siRNA를 피펫팅하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. transfection 시약과 개선된 최소 필수 배지를 siRNA에 첨가하고 피펫을 혼합합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 트랜스펙션 혼합물을 콜라겐 코팅된 플레이트의 각 웰에 추가합니다.

100mm 페트리 접시의 세포를 DPBS로 두 번 세척합니다. 세포에 5X 트립신을 첨가하여 전체 표면을 트립신으로 덮습니다. 30초 동안 기다렸다가 트립신을 조심스럽게 제거합니다. 인큐베이터에서 37 ° C에서 5-10 분 동안 페트리 접시를 배양합니다.

그런 다음 접시를 두드려 세포를 분리하여 세포 손상을 방지합니다. 피루브산이 없는 DMEM 10ml, 포도당 25mM, FCS 10%, 페니실린 및 스트렙토마이신 1%를 첨가하여 트립신을 중화합니다. 배지를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 세포를 분리하고 세포 현탁액을 균질화합니다.

Malassez 계수 챔버 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 세포 농도를 6.25 x 10⁵ cells/mL 배지로 조정합니다. 12-웰 플레이트의 웰당 800 마이크로리터의 세포 현탁액 또는 트랜스펙션 혼합물을 함유하는 24-웰 플레이트의 웰당 400 마이크로리터의 세포 현탁액을 시딩합니다.

세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양하고 24시간 동안 방해하지 마십시오. 다음 날, 상등액을 피루브산이 없는 신선한 DMEM, 포도당 25mM, FCS 10%, 페니실린 및 스트렙토마이신 1%로 조심스럽게 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.