Tol2 Transposon-Mediated Zebrafish Transgenesis: 수정된 제브라피시 배아에 Tol2 시스템을 동시 주입한 후 형질전환 제브라피시를 생성하는 절차

텍스트 프로토콜에 따라 Tol2 transposase mRNA와 주사 용액을 준비한 후 주입 전 오후에 최소 2명의 수컷과 2명의 암컷으로 구성된 4-6개의 번식 탱크를 설정했습니다. 물고기의 배설물의 양을 줄이고 번식 반응을 유도하려면 오후에 물고기에게 먹이를 주지 마십시오.

다음날 아침, 섭씨 80도의 마이너스 냉동고에서 준비된 주입액을 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. 물고기 사육 탱크의 칸막이를 당기고 물고기가 짝짓기를 할 수 있도록 합니다. 일반적으로 물고기는 20-30분 이내에 알을 낳습니다.

기다리는 동안 다음 매개 변수를 가진 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 모세관 유리에서 바늘을 당깁니다. 실험실용 물티슈를 사용하여 바늘 끝을 부러뜨리고 비스듬한 가장자리를 만듭니다. 배아 사망률을 줄이기 위해 더 작은 직경이 선호됩니다.

물고기가 알을 낳으면 직경 10cm의 페트리 접시에 모읍니다. 해부 현미경 바로 아래에서 모든 비정상적인 배아와 물고기 배설물을 제거합니다. 그런 다음 수정된 배아를 준비된 3% 아가로스 사출 금형에 피펫으로 넣습니다. 배아가 제자리에 고정되도록 여분의 물을 제거하십시오.

모든 줄이 생존 가능한 배아로 채워지면 단일 세포가 모두 바늘에 대해 수평으로 45도 각도를 향하도록 배열합니다. 이렇게 하면 나중에 주입이 훨씬 쉬워집니다. 다음으로, 장갑을 낀 상태에서 20마이크로리터 로딩 피펫 팁을 사용하여 얼음 위의 튜브에서 준비된 구조물 5마이크로리터를 제거합니다.

피펫 팁을 부러진 모세관 뒤쪽 끝에 조심스럽게 삽입하여 테이퍼링하기 시작하는 위치까지 시약을 팁에 최대한 가깝게 만들고 모세관으로 배출합니다. 그래도 기포가 남아 있으면 바늘 끝이 부러지지 않도록 바늘을 흔듭니다.

바늘을 마이크로 주입 바늘 홀더에 똑바로 삽입하고 바늘이 제자리에 고정될 때까지 조심스럽게 조인 다음 각도를 약 45도로 조정합니다. 바늘이 준비되고 부착되면 현미경과 가스 압력 탱크를 켭니다. 홀딩에는 약 0.5PSI, 배출에는 30PSI를 사용하여 주입량을 조정합니다.

페달을 밟을 때 바늘에서 용액이 나오는지 확인하십시오. 미네랄 오일 한 방울이 있는 스테이지 마이크로미터를 사용하여 용액의 부피와 흐름을 직경이 약 10마이크로미터로 조정합니다. 배압으로 인해 소량의 용액이 바늘에서 떨어질 수 있는지 확인하십시오.

배압이 충분하지 않으면 모세관 작용으로 인해 액체가 바늘에 들어가 mRNA를 파괴합니다. 바늘이 보정되면 젤 노치의 가장자리를 사용하여 수정된 배아의 단일 세포에 바늘을 삽입하여 배아를 제자리에 유지하고 배아를 움직이지 않고 바늘이 압력을 가할 수 있도록 하는 지지대를 제공합니다.

바늘 끝이 단일 셀에 들어가면 페달을 밟아 원하는 양의 용액을 방출합니다. 형질전환 제브라피시를 생성하기 위해 난황이 아닌 용액을 세포에 주입하는 것이 중요합니다. 모든 배아에 대해 이 과정을 반복합니다.

완료되면 일회용 3.4ml 전사 피펫과 물고기 시스템 물을 사용하여 주입된 배아를 아가로스 노치에서 헹궈 라벨이 부착된 접시에 옮깁니다. 배아를 섭씨 28.5도의 인큐베이터에 보관하여 배아가 발달할 수 있도록 합니다.