utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 신피질(neocortex)에 있는 신경 전구 세포(neuronal progenitor cell)의 특정 하위 집합에서 유전자의 녹다운(knockdown) 또는 과발현(overexpression)의 발달 효과를 조사하는 것입니다. 이는 신피질 전구 세포를 형질주입하기 위해 DNA를 쥐 배아로 생체 내에서 전기천공함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, transfection된 세포를 농축하기 위해 전기천공된 영역을 절부합니다.

다음으로, 이러한 세포를 챔버 슬라이드에서 해리하고 도금하고 배양합니다. 내인성 유전적 변형과 외인성 인자의 적용에 대한 영향을 조사하기 위해 avision 소프트웨어를 사용한 정량적 측정을 기반으로 신경돌기 성장 및 분지에 미치는 영향을 보여주는 결과를 얻었습니다. 1차 신경 세포 배양의 지질 기반 transfection과 같은 다른 기술에 비해 이 기술의 주요 장점은 신경 전구 세포의 특정 subset을 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다.

예를 들어, 글루타메이터성 뉴런만 이 방법을 사용하여 transfection됩니다. 또한, 우리는 초기 배아 단계에서 전기 기도를 할 수 있고 초기에 태어난 더 깊은 층의 뉴런을 표적으로 삼을 수도 있고, 발달의 후반 단계에서 전해질을 하고 피질의 더 표재적인 층을 목표로 하는 나중에 태어난 뉴런을 표적으로 삼을 수도 있습니다. 이 방법은 신경 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

예를 들어, 내적 요인과 외적 요인이 어떻게 상호 작용하여 신경 성장과 분기에 영향을 미칩니까? 이 방법은 신경 세포 과정 성장에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 시냅스 형성, 세포 증식 및 황산염 결정과 같은 다른 신경 발달 과정에도 적용할 수 있습니다. 첨부된 본문에 기술되어 있는 대로 주삿바늘을 준비한다.

거품을 피하고 GFP를 발현하는 DNA로 바늘을 다시 채우고 관심 유전자는 빠른 녹색을 포함합니다. 주사를 시각화하려면 바늘의 나머지 공간에 옥수수 기름을 넣습니다. 주입을 제어하기 위해 로드된 바늘에 피코 스프릿처를 부착합니다. 앞에서 설명한 대로 마취된 임산부 스프레이 doorly 쥐의 자궁 뿔을 노출시킵니다.

그리고 이 비디오와 함께 제공되는 텍스트에서 E 15 배아의 주입이 여기에 나와 있습니다. 구즈넥 램프로 배아를 밝혀 주사 부위를 확인합니다. 하나의 배아를 부드럽게 조작하여 머리가 있는 위치를 찾고 정중선 봉합사를 찾습니다.

이것을 외심실을 찾기 위한 랜드마크로 사용하십시오. 자궁벽을 통해 외심실로 DNA를 주입합니다. DNA로 채워질 때까지 심실에 여러 펄스를 주입합니다.

전극의 배치에 의해 결정되는 벡터는 신피질의 어느 영역이 전기천공화되어 있는지 결정하는 데 중요합니다. 여기서 양극은 전뇌의 이 영역을 표적으로 하기 위해 대뇌를 가로지르는 등쪽 내측 위치 근처에 배치됩니다. 전극의 교대 배치는 측면 피질 흐름(lateral cortical stream)을 포함한 피질의 다른 영역을 표적으로 합니다.

각 배아를 주입하고 전기천공합니다. 차례대로 자궁 뿔을 체강으로 되돌리고 절개 부위를 봉합합니다. 동물이 마취에서 회복하는 동안 모니터링하십시오.

여기에서 동물은 GFP가 검출될 수 있다 그래야, electroporation 후에 24 시간 배양을 위해 가을걷는다. 안락사된 쥐의 자궁에서 배아를 제거하고 얇은 판류 후드에 2가 양이온이 있는 얼음처럼 차가운 HBSS로 채워진 페트리 접시에 넣습니다. 그리고 형광 해부 현미경 아래에서 dumont number five pops를 사용합니다.

피질을 해부합니다. dumont 크기 번호 3 집게를 사용하여 수막을 제거하고 val 가위를 사용하여 형광을 켭니다. 조직의 GFP 양성 영역을 잘라냅니다.

이 조각을 2가 양이온 없이 얼음처럼 차가운 HBSS로 채워진 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브에 있는 모든 GFP 포지티브 조각을 수집합니다. 튜브에서 HBSS를 제거하고 섭씨 37도의 반전 인큐베이터에서 5분 동안 부드럽게 혼합한 0.25% 트립신 EDTA 용액 1ml로 교체합니다.

트립신 용액을 제거합니다. GFP 양성 조직의 양에 따라 1-5 밀리리터의 도금 매체로 교체하십시오. 2 밀리리터 스트라이프 피펫을 사용하여 세포를 해리하기 위해 5-7 번 먹었습니다.

혈구 분석기를 사용하여 혈구 분석기를 사용하여 2-3.5 배 10의 농도로 5 개의 세포를 CC 2 코팅 챔버의 각 챔버에서 1.5 밀리리터의 중간 플레이트 1.5 밀리리터 농도로 계산합니다. 슬라이드. 세포가 슬라이드에 부착될 수 있도록 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 배양합니다. 도금 배지는 챔버 배양당 1.5 밀리리터의 뉴런 배지를 흡인하였다.

세포를 섭씨 37도에서 면역 염색을 진행하기 전에 원하는 단계로 이동합니다. 신경 세포 과정의 측정을 위해. 성장 시기 배양은 24시간에서 7일 사이에 다양합니다.

흄 후드에서 각 배양 챔버의 배지를 흡인합니다. 4% 포름알데히드로 세포를 15분 동안 고정합니다. 함께 제공되는 텍스트에 자세히 설명된 대로 배양물에서 볼 수 있는 차단 및 면역 전에 한 번 PBS로 두 번 빠르게 세척하고 형광 장착 매체와 커버 슬립으로 배양물을 장착합니다.

형광 현미경으로 20x에서 배양물을 시각화합니다. 분석을 위해 GFP 양성 뉴런의 이미지를 기록합니다. 우리는 이 기술을 통해 전기로 porated 된 뇌의 약 75 %가 등쪽 내측 피질 또는 복부 외측 피질이든 피질의 원하는 영역을 표적으로 한다는 것을 발견했습니다.

우리는 E에서 13-14 개의 TBR, 1 개의 긍정적 인 층, 6 개의 뉴런과 같은 심층 뉴런을 대상으로 한 초기 electroporation을 발견했으며, 나중에 electroporation 타겟 CT IP 2 개의 긍정적 인 TBR 1 개의 음층 5 개의 세포, 더 늦은 electroporation 타겟 BRN 2 개의 긍정적 인 레이어 2 개의 슬래시 3 개의 세포를 발견했습니다. 여기에서 우리는 배아 15.5일 또는 17.5일에 전기천공되고 출생 후 5일째에 적출된 뇌의 관상 절편을 보여줍니다. 배양에서 A GFP 양성인 세포의 비율은 GFP 양성 영역을 해부할 때 얼마나 보수적인지에 따라 크게 달라질 수 있습니다.

그러나 매우 보수적으로 GFP 양성 세포 패치만 해부할 때에도 관찰할 수 있는 가장 높은 비율은 5-10%입니다.이 낮은 transfection 효율은 분석 중인 electroporated cell에 속하는 프로세스를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이 더 높은 밀도로 세포를 도금하면 더 건강한 배양에 기여합니다. 그러나 GFP 음성 세포에서 어떤 과정이 어떤 세포체에 속하는지 식별하기 어렵습니다.

이 절차에 따라 증식, 시냅스 형성 및 황산염 측정에 관한 질문에 답하기 위해 여러 가지 다른 마커에 대해 면역 염색을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 오염 및 감염을 방지하기 위해 멸균 시약과 도구를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 각 측면은 적절하게 수행되면 2-3시간 내에 수행할 수 있습니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.