어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

우리의 시각적 경험은 망막 광수용체의 시각 색소가 빛 에너지의 광자를 흡수할 때 시작되며, 궁극적으로 세포막의 고리형 뉴클레오티드 게이트 채널을 폐쇄합니다. 이것은 간상체와 원추세포에서 신경전달물질인 글루타메이트의 방출을 억제합니다. 방출된 글루타메이트는 다운스트림 망막 세포에 의해 감지되어 다운스트림 신호를 연구합니다.

안락사된 쥐에서 눈을 제거합니다. S는 분리되어 한천 블록에 삽입되고 진동하는 마이크로톰을 사용하여 얇게 썰어집니다. 다음으로, 망막 절편을 현미경 아래에 놓고 LED 조명으로 자극합니다.

패치 클램프 기록은 생성된 시냅스 전류 또는 전위를 측정하기 위해 수행됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 어둠 속에서 작업하는 복잡성이 추가되어 어려움을 겪을 것입니다. 따라서 전체 프로세스를 시각화할 수 있으면 설명하기 어려운 느낌을 얻을 수 있습니다.

염화은 층과 함께 사용할 기록 및 참조 와이어 전극을 코팅하여 이 절차를 시작합니다. 전극을 1몰 염화나트륨에 담그십시오. 그런 다음 15볼트 전원을 사용하여 1헤르츠 사인파가 15볼트를 약 20초 동안 사이에 구동합니다.

마이크로 피펫 풀러를 사용하여 화염 광택 BO 실리카 유리로 패치 피펫을 준비하고 직경이 약 20미크론인 세포체의 표적 세포 크기에 따라 피펫 팁 저항을 선택합니다. 세포체에 대해 팁 저항이 5-10메가옴인 파이프 PET를 사용하십시오. 직경이 약 5미크론 이후에는 12-15메가옴의 팁 저항을 사용하십시오.

접지 기준 전극을 준비하려면 주사기를 사용하여 1밀리몰 염화나트륨으로 준비된 3.5% 한천 용액으로 폴리에틸렌 튜브를 채웁니다. 다음으로, 함께 제공되는 서면 프로토콜의 지침에 따라 다음 솔루션을 준비합니다. 외부 수조 용액 슬라이싱 용액, 아스파르트산 칼륨 피펫 내부 용액 및 한천 백스톱.

필요할 때까지 모든 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 실험 당일, 토르는 약 1.5 밀리리터의 아스파르트 칼륨 내부 용액을 투여했습니다. 그런 다음 희석된 형광을 추가합니다.

중탄산나트륨이 포함된 약 50ml의 목표 매체를 가벼운 밀폐 보관 용기에 붓습니다. 플라스틱 튜브를 5%의 이산화탄소와 95%산소가 들어 있는 가스 탱크에 연결하여 목표 매체를 가스와 평형을 이룬 다음 용기를 섭씨 30-32도의 수조에 넣습니다. 다음으로, 병에 110ml의 조준액, 완두콩이 들어있는 매체를 채우고 얼음 위에 놓습니다.

용액을 100% 산소 가스로 버블링하여 매체를 동일시합니다. 중탄산나트륨을 포함하는 나머지 조준 매체를 패러데이 케이지 상단의 가열된 저장소에 놓습니다. 튜브와 병 상단 주위에 파라폼을 감싸 용액 위의 공간에 가스를 가두고 5% 이산화탄소, 95% 산소 가스로 평형을 이룹니다.

유리 공기 분산 튜브를 사용하여 25ml의 목표 배지에 0.75g을 첨가하여 3%낮은 겔화 온도를 준비합니다. 용액은 교반하는 동안 약 섭씨 115도입니다. 용액이 거품 없이 투명해지면 녹인 한천 용액을 섭씨 42도의 수조에 넣습니다.

도립 현미경에 기록 챔버를 설정합니다. 5cm 한천 브리지를 은, 염화은 기준 전극 위로 밀어 넣고 기록 챔버에 배치합니다. 피펫 팁 저항은 피펫에 내부 용액을 채우고, 피펫 홀더에 놓고, 피펫 홀더를 증폭기 헤드 스테이지에 넣고, 생리학적 기록을 위해 시각적 색소를 보존하기 위해 피펫을 용액으로 낮추어 측정할 수 있으며, 모든 절차는 적외선 고글을 사용하여 적외선 아래에서 수행해야 하지만 모든 절차는 실내 조명에서 표시됩니다.

쥐를 안락사시킨 후 구부러진 가위를 사용하여 눈을 빠르게 제거합니다. 눈이 굴러가지 않도록 여과지 조각에 눈을 놓습니다. 그런 다음 집게로 눈을 제자리에 고정하고 얇은 양면 칼날을 사용하여 각막에 구멍을 냅니다.

안구에 구멍이 뚫리자마자. 조준 매체로 채워진 60mm 페트리 접시에 눈을 옮깁니다. 각막의 틈새를 진입점으로 사용하여 작은 가위를 사용하여 각막의 나머지 부분을 잘라냅니다.

그런 다음 수정체와 유리체액을 제거하여 망막이 안구컵에 부착된 상태로 유지되도록 합니다. 조준으로 채워진 가볍고 단단한 용기에 넣으십시오. 매체는 섭씨 32도에서 95% 산소에 5% 이산화탄소와 평형을 이룹니다.

다음 헤미스 sec. 10번 메스 칼날을 사용하는 아이컵 중 하나. 망막과 망막 색소 상피를 분리합니다.

조직이 평평하게 살아날 수 있도록 망막의 가장자리를 제거합니다. 라텍스 전구가 있는 작은 유리 파스타 피펫을 사용하여 35mm 페트리 접시에 녹은 저겔화 온도의 한천을 채우고 한천을 통해 집게를 드래그하여 일관성을 테스트합니다. 한천이 응고되기 시작하면 망막을 한천 상단으로 옮깁니다.

그런 다음 망막을 건드리지 말고 꼬인 Kim 와이프 조각을 사용하여 주변의 여분의 용액을 흡수합니다. 한천 2-3방울을 망막에 직접 떨어뜨리고 플라스틱 실린더를 빠르게 배치하여 주위에 벽을 형성하면서 실린더 중앙 근처에 망막을 유지하면서 추가로 녹은 한천을 떨어뜨리고 페트리 접시를 얼음물 욕조에 옮겨 식힙니다. 30초 후 조직을 제거하고 플런저를 사용하여 망막에서 가장 먼 쪽에서 밀어 한천 블록을 압출합니다.

단면 면도날을 사용하여 망막이 들어 있는 작은 한천 블록을 잘라내고 블록을 표본 디스크의 한천 백스톱에 대고 단단히 붙입니다.표본 디스크를 진동하는 마이크로톰 나무로 옮기고 얼음처럼 차가운 조준 더미를 나무에 부어 망막이 있는 블록이 완전히 잠길 수 있도록 합니다. 약 200미크론 두께의 망막 절편을 최대 블레이드 진동 속도로 전진 블레이드 속도를 설정하여 망막을 절단하는 데 4-5초가 걸리도록 절단합니다. 한번.

숫자 11 메스 날을 사용하여 블록에서 사용 가능한 각 조각을 한 번에 하나씩 자릅니다. 망막이 들어 있는 절편을 기록실에 넣고 누르고 있습니다. 슬라이스 앵커를 사용하여 슬라이스 앵커를 교차하는 나일론 나사산을 사용합니다.

망막을 둘러싼 한천을 누르고 망막이 막히지 않도록 합니다. 녹음용. 기록 챔버를 s로 옮깁니다.tag정립 현미경의 e.

커튼을 닫고 적외선 광원을 켜서 view 적외선에 민감한 카메라에서 슬라이스를 봅니다. 현미경으로 적절한 절단 각도에서 광수용체가 손상되지 않은 망막 절편을 식별합니다. 슬라이싱 과정으로 인해 일부 표면 손상이 명백할 수 있습니다.

끝이 부러진 피펫을 사용하여 죽은 세포체를 부드럽게 빨아들입니다.이 얇은 세포층을 제거하기 위해 건강한 살아있는 세포층이 드러나면 관심 층에 위치한 세포체를 식별합니다. 세포막이 움푹 들어가도록 피펫 팁을 이동하고 완만하게, 음압 또는 안쪽으로 압력을 가하여 높은 저항성을 가진 밀봉을 만듭니다. 전체 셀 모드는 전극에 음압을 가하여 셀에 침입함으로써 달성할 수 있습니다.

다음으로, LED를 사용하여 빛으로 망막 조직을 자극하여 반응을 유발합니다. 기록이 끝나면 파이펫 내부 용액에서 세포로 투석된 Fluor에 적합한 여기광을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 여기서, 점점 더 강해지는 빛의 섬광에 어둡게 적응된 망막 뉴런의 빛을 불러일으킨 전위가 표시됩니다.

이 그림은 세포가 Fluor Lucifer yellow로 채워진 망막 절편에서 촬영한 형광 사진으로, 패치 기록이 이루어진 세포의 형태를 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 어둡게 조정된 망막 절편에서 패치 클램프 녹음을 만드는 것의 몇 가지 복잡성을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다. 이 절차의 목표는 제어된 조명에서 빛을 유발하는 반응을 측정하는 것입니다.

이를 위해서는 먼저 망막을 분리하여 오거에 삽입한 다음 단일 세포 기록을 만들 수 있는 망막 절편을 준비해야 합니다.