Name: 어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 학습하세요 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 전기생리학 기록을 위한 어두운 적응 슬라이스 준비 방법을. 아가 블록에 포매하고 진동 마이크로톰으로 절단하여 시각 신경과학 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH 그랜트 EY17606 (APS)에 의해 지원되었다.

1. 준비 전극 <ol><li> 1M NaCl의 모두를 수영하고 둘 사이 15V 운전 ~ 20 S.에 대한 1 Hz에서 사인 파를 사용하여 녹음과 참조 전극을 준비 </li><li> micropipette 풀러 (서터 인스 트루먼 트의 P - 97을)를 사용하여 기록 전극을 만듭니다. 패치 - pipettes은 1.2 mm의 외부 직경 0.69 mm (셔터 인 스트 루먼트, 고양이 # B120 - 69 - 10)의 내경과 borosilicate 유리를 사용하십시오. 전극의 끝부분을 통해 일련의 저항을 측정합니다. MΩ ~ 12 세포 기관에 대한 MΩ ~ 5 ~ 직경 5 μm의 사용 세포 기관에 대한 ~ 직경 20 μm의 사용, 피펫 팁 직경을 선택 대상 세포의 크기에 따라. </li><li> 지상 / 참조 전극을 준비합니다. 1M NaCl에서, 주사기를 사용하면 (CAT # A7002 시그마) 3.5 % 아가르를 포함 1 ㎜ NaCl과 작은 섹션 폴리에틸렌 튜브 (Intramedic, PE205)를 입력합니다. 자세 / AgCl 기준 전극을 통해이 한천 다리를 놓습니다. </li></ol> 2. 준비 솔루션 <ol><li> 외부 목욕 솔루션, 에임스 '비카보네이트 (1 패)를 포함하는 미디어 : 에임 스의 1 병'중간 (시그마, 고양이 # A1420), NaHCO 3 1.9 g 페니실린 - 스트렙토 마이신 7 ML (시그마, 고양이 # P0781) 세균 방지 성장. ~ 280 mOsm에 osmolarity를​​ 조정합니다. </li><li> 솔루션을 깔끔히, 에임 '산도 버퍼 HEPES (1 패)를 포함하는 미디어 : 에임 스의 1 병'매체, NaCl의 0.887 g, 2.38 g HEPES의 페니실린 - 스트렙토 마이신 7 ML. 1M NaOH 및 / 또는 1M HCL을 사용하여 ~ 7.4으로 산도를 조정합니다. ~ 280 mOsm에 osmolarity를​​ 조정합니다. </li><li> 칼륨 - Aspartate (K - ASP) 피펫 내부 솔루션 (MM)을 : 125 K - Aspartate은 10 KCl, 10 HEPES, 5 NMG - HEDTA, 0.5 CaCl 2, 1 ATP - MG, 0.2 GTP - MG, 산도가 조정됩니다 와 ~ 7.3 NMG는 - 아, 그리고 osmolarity는 280 mOsm ~하도록 조정됩니다. </li><li> 망막을 포함한 낮은 겔화 온도 아가로 오스 (무게로 5 %), 아가르의 7.5 G (시그마, 고양이 # A7002)를 안정화에 대한 아가르 역전은 DH 2 O. 150 ML에 녹아 </li></ol> 3. 실험의 날 <ol><li> 해동 ~ K - ASP 내부 솔루션과 냉동고에서 원하는 형광단 1.5 ML. 경험적으로 결정되어야하는 적절한 농도에 형광단을 희석. </li><li> 물 목욕 (30-32 ° C)에 가벼운 꽉 스토리지 컨테이너와 다음 장소로 NaHCO 3 (~ 200 ML)이있는 에임스 '미디어를 붓고 5 %의 CO 2 / 95% O 2 가스를 평형 </li><li> 얼음 HEPES, 장소를 포함하는 에임스 '미디어 ~ 110 ML과 병을 채우기 및 100 % O 2 평형. </li><li> 패러데이 케이지 위에 온수 저수지에서 NaHCO 3가 들어있는 나머지 에임스 '미디어를 삽입하고, 5 % CO 2 / 95% O 2 기체와 평형. Parafilm는 솔루션 위의 공간에 가스를 트랩하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> HEPES와 ~ 115 ° C 아가로 오스를 녹기에서 열 솔루션 에임스 '미디어의 25 ML한다 (CAT # A0701 시그마) 0.75 g을 추가하여 낮은 겔화 온도 아가로 오스 (3 %)를 준비합니다. 물을 욕조에서 거품없이 명확하고, 저장하는 솔루션까지 저어 (~ 42 ° C). </li><li> K - ASP 내부 솔루션과 함께 녹음 피펫을 채울 및 팁 저항을 확인하십시오. </li></ol> 4. 실험 시작 <ol><li> 마우스를 안락사 신속하게 곡선 가위를 사용하여 눈을 제거합니다. 적외선 고글은 시각 색소의 표백 방지하기 위해 모든 절차를 사용해야합니다. </li><li> 포셉로 시선을 누른 상태 압연, 그리고 얇은 이중 단면 블레이드를 사용을 방지하기 위해 필터 종이에 눈을 장소, 각막에 슬릿합니다. </li><li> 곧 눈알이 구멍이므로, 에임스 '미디어 가득한 그릇에 사람들이 시선을 전송합니다. </li><li> 진입 점으로 각막에 슬릿을 사용하여, 작은 가위는 렌즈와 유리를 제거할 수있는 후 각막의 나머지 부분을 버려야하는 데 사용됩니다. 망막은 세안 컵에 부착된 상태, 32에서 어둠의 세안 컵을 저장 ° C를 5 % CO 2 / 95% O 2 equilibrated 에임스 '미디어에주의하십시오. </li></ol> 5. 깔끔히 <ol><li> eyecups 중 하나를 Hemisect 및 망막 안료 상피에서 망막을 떼어 놓다. 조직이 평평 거짓말 수 있도록 망막의 가장자리를 제거합니다. </li><li> 녹인 한천과 함께 35mm 페트리 접시를 채우기 위해 라텍스 전구와 작은 유리 파스퇴르 피펫을 사용하고 일관성을 테스트하는 한천을 통해 전체 포셉를 끕니다. </li><li> 당신은 한천이 응고 볼 시작할 수 있습니다 경우 : <ol class="lalpha"><li> 한천의 상단에 망막을 전송합니다. </li><li> 망막 주위의 여분의 솔루션을 흡수 Kimwipe의 뒤틀린 조각을 사용합니다. </li><li> 장소 2-3 망막에 직접 아가르의 방울 신속하게 주위 벽을 형성하기 위해 망막을 통해 플라스틱 실린더를 놓으십시오. 한천 이내에 망막을 중심으로하면서 그런 다음 플라스틱 실린더의 측면 아래 추가 녹인 한천 드립. </li><li> 페트리 접시 T를 전송냉각 얼음 물 목욕 O. </li></ol></li><li> ~ 45 초 얼음 물을 욕조에서 조직을 제거하고 한천은 망막에서 멀리 측면에서 추진, 플라스틱 실린더 밖으로 블록 돌출하는 플런저를 사용하면. </li><li> 망막을 포함 한천의 작은 블록을 잘라 표본 디스크에있는 한천 역전에 대한 장소에 블록을 superglue하는 일방적인 면도날을 사용합니다. </li><li> 진동 마이크로톰 트레이에 표본 디스크를 전송하고 망막과 블록이 완전히 물 속에 잠긴 수 있도록 트레이에 얼음 차가운 에임스 HEPES 잔. </li><li> ~ 200 μm의의 두께 망막 조각은 최대 블레이드 진동 속도로 잘라 앞으로 블레이드 속도는 각각의 슬라이스에있는 망막을 통해 줄일 4-5초 걸립니다 이러한 설정할 수 있습니다. </li><li> 한 번에 하나씩 각 사용 가능한 슬라이스 하나를 제거하는 11 호 메스 블레이드를 사용하여 </li><li> 망막을 포함한 좋은 조각은 기록 챔버에 배치하고 그들을 건너 나일론 스레드와 슬라이스 앵커와 함께 아래 가중치 있습니다. 나일론 스레드는 레코딩을위한 가리지 망막을 떠나, 망막을 둘러싼 한천을 누르십시오. </li><li> 똑바로 현미경의 무대에 녹화 실로 전송, 커튼을 닫고 적외선에 민감한 카메라에 슬라이스를 볼 수있는 적외선 광원을 설정합니다. </li></ol> 6. 녹음 <ol><li> 일단 좋은 망막 슬라이스는 (그대로 photoreceptors하고 적절한 절단 각도) 속도로 망막을 perfusing 시작 확인된 35 37 가열 가열 에임스 '매체와 이상 5 ML / 분 ° C와 5 % CO 2 equilibrated / 95% O 2. </li><li> 일부 표면 손상이 깔끔히 처리로 인해 뚜렷한 수 있습니다. 세포의이 일반적으로 얇은 레이어가 부러 팁있는 피펫을 사용하여 제거하고, 부드럽게 죽은 세포의 시체를 멀리 빠는 수 있습니다. 이것은 일반적으로 살 세포를 아래에 공개합니다. 그의 위치에 대한 관심의 지층에 위치하고 건강한 세포 기관을 식별합니다. </li><li> KAsp 내부 솔루션 micropipette을 입력하고 피펫의 팁을 통해 긍정적인 (외부) 압력을 적용하고, 아래 micromanipulator를 사용하여 세포의 수준으로 기록 챔버에 피펫의 팁을 낮은합니다. </li><li> 그것은 세포막을 보조개 이러한 피펫 팁을 이동하고, 높은 저항 인감 수 있도록 부드러운 부정 (안으로) 압력을 적용합니다. 전체 셀 모드는 세포에 침입하기 위해 전극에 부정적인 압력을 적용하여 얻을 수 있습니다. </li><li> LED를 사용하여 망막 조직을 자극하면 다음 빛에 반응을 보여주고 있습니다. </li><li> 녹음이 피펫 내부 솔루션에 형광단에서 형광을 evoking에 의해 만들어진있는 세포 모습을 사진에 담아보세요. </li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 여기는 어두운 적응 증가 강도의 빛을 깜박하는 망막 신경 세포 것이 표시됩니다의 가능성에 불을 - evoked. <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 세포가 형광단, 루시퍼 노란색으로 가득했습니다 망막 슬라이스에서 형광 사진. Evoked 형광이 패치 레코딩이되었다하는 세포의 형태를 보여줍니다.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

척추 망막에서 슬라이스 녹음 수십 년 1,2에 대해되었습니다, 그리고 망막 회로는 입사 광을 인코딩하는 방법에 깊은 이해를 제공하는 매우 성공적으로되었습니다. 진동 마이크로톰와 절삭 오히려 직접보다 면도날로의 장점은 망막 조각이 표면에 덜 손상을 초래한다는 것입니다. 흡입 피펫으로 그것은 단지 세포 유형의 대부분 5,6을 확인했습니다 망막 회로, 그들의 연결을 유지 표면 아래 손상 및 대상 건강한 세포를 제거하는 간단하고, 표시되는 강력한 반응을 빛을 수 있습니다. 따라서 어두운 적응 망막 조각의 패치 클램프 녹음 신경 계산에서 확인 휴대 클래스에 의해 재생 역할을 결정하기 위해 조사를 허용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜브</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>한천(Agar)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>Ames&amp;rsquo; 배지</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

우리의 시각적 경험은 우리의 망막 photoreceptors의 시각 색소가 빛 에너지의 광자를 흡수하여 세포막의 순환 - 염기 - 문이 채널의 폐쇄로 이어질 세포 사건의 폭포를 시작하면 시작됩니다. 멤브레인 전위의 결과로 변경 막대와 원뿔 시냅스 터미널 모두에서 신경 전달 물질 방출의 양을 감소에 차례로 연결됩니다. photoreceptor 막 잠재력에 가벼운 evoked 변화가 망막에 하류 활동으로 연결 방법을 측정하기 위해 과학자들은 수십 년 1,2에 대한 망막 슬라이스 준비에서 electrophysiological 음반을 만들었습니다. 과거에는 이러한 조각은 거름종이에 첨부되어 망막 조직에 면도날로 수동으로 절단되었습니다;과 함께 최근 몇 년 동안 깔끔히의 또 다른 방법은 망막 조직이 낮은 겔화 온도 한천 배지에 포함된 의하여 개발되었으며 냉각 솔루션에 슬라이스 마이크로톰 3,4 진동. 이 준비가 덜 표면 손상이 매우 강력한 빛을 evoked 반응과 함께 망막 조각을 생산하고 있습니다. 여기 우리는이 절차는 시각 색소를 표백되지 않도록 적외선에 따라 할 수있는 방법을 문서.

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

우리의 시각적 경험은 망막 광수용체의 시각 색소가 빛 에너지의 광자를 흡수하여 다음과 같은 일련의 반응을 유도할 때 시작됩니다...

우리의 시각적 경험은 망막 광수용체의 시각 색소가 빛 에너지의 광자를 흡수함으로써 시작되며, 이는 최종적으로 세포막의 cyclic nucleotide gated channel의 폐쇄로 이어집니다. 이는 간상세포와 원추세포 모두에서 신경전달물질인 glutamate의 방출을 억제합니다. 방출된 glutamate는 하위 망막 세포에 의해 감지되어 하위 신호를 연구하는 데 사용됩니다.안락사시킨 마우스에서 안구를 적출합니다. S를 분리하여 한천 블록에 매립한 후 진동 마이크로톰을 사용하여 절편을 만듭니다. 다음으로, 망막 절편을 현미경 아래에 배치하고 LED 조명으로 자극합니다.시냅스 전류 또는 전위를 측정하기 위해 패치 클램프 기록을 수행합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 암실에서 작업해야 하는 추가적인 복잡성으로 인해 어려움을 겪습니다. 따라서 전체 과정을 시각적으로 확인하는 것은 말로 설명하기 어려운 실질적인 감각을 익히는 데 도움이 될 것입니다.사용할 기록 및 기준 전극 와이어를 염화은 층으로 코팅하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 전극을 1 M 염화나트륨 용액에 담급니다. 그런 다음 1 Hz 사인파 구동 방식의 15 V 전원을 사용하여 약 20초 동안 두 전극 사이에 15 V를 인가합니다.마이크로 피펫 풀러를 사용하여 화염 연마된 BO 실리카 유리로 패치 피펫을 제작하며, 직경 약 20 µm의 세포체와 같은 표적 세포의 크기에 따라 피펫 팁 저항을 선택합니다. 세포체의 경우 5~10 MΩ의 팁 저항을 가진 피펫을 사용하십시오. 직경이 약 5 µm 이하인 경우에는 12~15 MΩ의 팁 저항을 사용하십시오.접지 참조 전극을 준비하려면, 1 mM 염화나트륨으로 조제한 3.5% agar 용액을 시린지를 사용하여 폴리에틸렌 튜브에 채웁니다. 다음으로, 동봉된 서면 프로토콜의 지침에 따라 외부 배스 용액(external bath solution), 절편 제작 용액(slicing solution), potassium aspartate 피펫 내부 용액 및 agar 백스톱(backstop) 용액을 준비합니다.모든 용액은 필요할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 실험 당일에 약 1.5 mL의 potassium aspartate 내부 용액을 넣습니다. 그다음 희석된 Fluor를 추가하십시오.중탄산나트륨이 포함된 aims 배지 약 50 milliliters를 차광 보관 용기에 붓습니다. 가스 탱크에 연결된 플라스틱

patch-clamp-recordings-from-mouse-retinal-neurons-dark-adapted-slice

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 수생 호랑이 도롱뇽의 망막 통에 전체 셀 전압 클램프 레코딩 과정을 보여줍니다. 우리는뿐만 아니라 망막의 시각적인 자극하는 동안 패치 클램프 레코딩을 수행하는 방법으로 슬라이스의 준비를 보여줍니다.

라이트의 전체 세포 레코딩은 망막 통에 흥분성의 시냅틱 전류를 Evoked

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여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

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마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

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Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

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