Name: 3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 3령 애벌레의 축삭 수송 메커니즘을 면역형광 현미경으로 연구하는 방법을. 돌연변이와 야생형 비교를 통해 신경계 발달 및 단백질 국소화를 분석할 수 있습니다.

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SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.

1. 시약의 준비 <ol><li> 128 MM NaCl, CaCl 4mm짜리 2, 4mm짜리 MgCl 2, 2 KCl MM, 5mM HEPES 및 36mM 자당를 사용하여 절개 1X 버퍼를 준비합니다. PH 7.2 솔루션 및 필터 소독. </li><li> 16 % 포름 알데히드 및​​ 1X 해부 버퍼의 1시 1분 희석을 사용하여 정착액을 준비합니다. </li><li> 1X 인산을 사용하여 1X PBT 준비 살린 (PBS)는 1:100 비율 7.2 그리고 Triton X - 100의 PH에 버퍼. </li><li> 준비 5% 소 혈청 0.01 %가 1X PBS에서 Azide 나와 함께 (BSA) 알부민. </li></ol> 2. 해부를위한 준비 <ol><li> Sylgard 요리는 절개에 사용됩니다. Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 기지를 따르고하고 페트리 접시에 에이전트 혼합물을 치료하여 요리를 준비합니다. 혼합물이 완전히 사용하기 전에 응고 및 건조 수 있습니다. </li><li> 절개 전에 깨끗한 # 5 포셉의 쌍, 직선 블레이드 vannas 가위의 클린 쌍, 그리고 핀을를 수집합니다. </li></ol> 3. 제 3 Instar의 애벌레의 해부 <ol><li> 배양 접시에 특정 유전자형 3 차 instar의 애벌레를 헤매고 수집합니다. </li><li> 음식 없애 탈이온수에서 애벌레를 씻으십시오. </li><li> 등의 측면까지 함께 sylgard 요리에 유충 놓으십시오. 그 앞쪽에 및 사후 끝에 유충을 핀. </li><li> 고정된 유충에 1X 해부 버퍼의 드롭 놓습니다. 고급 가위 따다에게 사후 끝 근처 등의 정중선에 유충을 사용합니다. 가위를 사용하여 앞의 끝에 통해 사후 하순부터 애벌레 표피를 잘라. </li><li> 해부 유충에 새로운 1X 해부 버퍼의 드롭 놓습니다. PIN을 사용하여 유충의 중간 근처 표피 중 하나 측면 가장자리를 선택하고 표피를 핀. 다른 핀 사용으로 그림과 같이 표피의 두 번째 측면 가장자리를 핀. 두 핀이 각 측면 측면에 사용됩니다. 아래 다이어그램을 참조하십시오. </li><li> 조심스럽게 첨부 segmental 신경 함께 두 개의 광학 엽 (叶)과 복부 신경만을 두뇌를 떠나, 창자, 지방 단체 및 기관을 제거하십시오. 절차의 나머지 부분은 sylgard 요리에 이루어집니다. </li></ol> 4. 해부 유충의 고정 <ol><li> 매 15 분 수정을 대체하여, 30 분 수정의 해부 유충 부화. </li><li> 고정 후, 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT의 유충을 씻어. 유충은 항상 버퍼에 있​​어야합니다하는 것이 중요합니다. </li></ol> 5. 해부 유충의 항체 스테 이닝 <ol><li> 1X PBT에서 나 Azide와 5 % BSA의 적절한 농도를 diluting하여 기본 항체를 준비합니다. 최적의 농도는 다른 항체를 위해 다를 수 있습니다. </li><li> 마지막 1X PBT은 준비된 차 항체 솔루션 린스, 4 ° C 하룻밤에 습기가 실내에 품어 바꿉니다. 습기 챔버가 물에 젖었 김 - 잎사귀와 플라스틱 접시를 안감으로 구성되어 있습니다. </li><li> 그 다음날, 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT에서 해부하는 유충을 씻어. </li><li> 1X PBT에서 나 Azide와 5 % BSA의 적절한 농도를 diluting하여 이차 항체를 준비하고, 한 시간 동안 25 ° C에서 차 항체 솔루션 유충 부화. 이차 항체가 민감한 빛 있으므로, 빛을 방지하기 위해 호일에 습한 챔버를 바꿈. </li><li> 부화 후 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT의 유충을 씻어. </li></ol> 6. 장착 및 해부 유충의 시각화 <ol><li> 슬라이드에있는 유충을 설치하기 전에 (그림 참조)에 앉을 수있는 커버 슬립을위한 충분한 공간, 중간에 매니큐어 두 수직선을 확산하여 슬라이드를 준비합니다. 완전히 손톱 폴란드 건조하자. </li><li> 슬라이드에서 세로 매니큐어 라인 (그림 참조) 사이의 공간에 장착 버퍼의 한 방울을 넣으십시오. 슬라이드 이제 설치 준비가되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="그림 1 단계 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1 단계 6.2"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="그림 2 단계 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2 단계 6.2"></li><li> 마지막 1X PBT는 린스 후, 부드럽게 측면 핀을 제거합니다. 표피 찢어하지 않도록주의한다. </li><li> 조심스럽게 두 남은 핀을 제거하고 집게로 유충을 선택하고 준비 슬라이드 수평 유충을 놓으십시오. 유충이 이상의 이성을 상실하고 지향 복부 측면가 없습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 부드럽게 위에 커버 용지를 놓고 (그림 참조) 매니큐어와 가장자리를 밀봉. 유충 지금은 형광 현미경으로 시각화를위한 준비가되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="그림 1 단계 6.5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1 단계 6.5"></li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 야생 유형 larv에서 애벌레 segmental 신경의 대표 이미지(CSP, Zinsmaier 외. 1994) 시냅스 소포 단백질 시스테인 문자열 단백질에 대한 항체를 사용하여. segmental 신경이 원활하게 스테인드됩니다. 바 = 20μm <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 시냅스 소포 단백질 시스테인 문자열 단백질 (CSP)에 대한 항체를 사용하여 모터 단백질 돌연변이 유충에서 애벌레 segmental 신경의 대표 이미지. segmental 신경이 CSP (화살표)에 대한 밝은 얼룩 거대한 축적을 표시합니다.

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Drosophila 애벌레 segmental 신경 axonal 교통 메커니즘을 연구하기위한 강력한 시스템입니다. 3 차 instar 애벌레의 절개가 올바르게 수행하는 경우, 등 근육과 NMJs 같은 CNS, PNS, 및 관련 조직, 모든 구성 요소는 하나의 유충 이내에 검사를하실 수 있습니다. 우리는 허드와 색스턴 (1996)에 의해 출판 하나에서이 프로토콜을 적응있다. 이 프로토콜은 다른 항체의 연결을 테스트하는 적응 될 수 있지만, 항체의 최적화 할 수 있습니다. 기본 및 보조 항체 보육 시간은 변경될 수 있습니다 또는 차단 단계는 추가할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 아밀로이드 전구체 단백질 1과 axonal 교통 Huntingtin 2의 역할을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Minutien 핀, 스테인리스강</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Mcpherson-Vannas 직선형 블레이드 8cm 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 마운팅 매질</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머</td><td>Dow Corning</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

3 애벌레 segmental 신경의 시각화 차 instar drosophila 애벌레 준비

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster 특히 때문에 편리 유전 완전 합성 게놈의 신경 계통의 발달과 기능을 연구를위한 강력한 모델 시스템으로 대두되고 있습니다. 또한, 애벌레 신경 시스템은 애벌레 segmental 신경이 신체의 길이를 따라 결말 두뇌 및 신경 터미널 내에있는 자신의 세포 기관과 axons의 번들을 포함하는 등 axonal 교통의 메커니즘을 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 여기 애벌레 segmental 신경 사이 시냅스 소포 단백질의 시각화를위한 절차를 설명합니다. 제대로하면, 신경 시스템의 모든 구성 요소는 이러한 근육과 NMJs 등 관련 조직과 함께, 손상 손상 및 시각 준비가 남아있다. 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레가 해부되고, 고정 시냅스 소포 항체와 incubated, 시각 및 야생 입력 유충에 비해. 이 절차는 쉽게 애벌레 segmental 신경 내에서 볼 수 있습니다 단백질의 다양한 배포판에 여러 다른 시냅스의 연결 또는 항체 및 변경 적용할 수 있습니다.

Drosophila melanogaster의 애벌레가 애벌레 segmental 신경 이내 axonal 수송의 메커니즘을 조사하기 위해 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 이 절차를 사용하여 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레는 야생 타입 애벌레 비교할 수 있습니다.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

*Drosophila melanogaster*는 특히 ... 덕분에 신경계의 발달과 기능을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 부상하고 있습니다.

유충의 마디 신경을 시각화함으로써 축삭 수송을 연구할 수 있습니다. 3령 초파리 유충의 사례입니다. 먼저 유충을 해부하여 시각 엽, 복측 신경절 및 마디 신경을 손상시키지 않고 중추신경계(CNS)를 노출시킵니다.절차의 두 번째 단계는 포름알데히드(formaldehyde)로 라바(lava)를 고정한 후, 1차 항체와 함께 하룻밤 동안, 그리고 2차 항체와 함께 암실에서 1시간 동안 배양하는 것입니다. 그 다음 라바를 유리 슬라이드에 마운트하여 축삭 수송 결함을 확인합니다. 단백질 국소화 및 단백질 분포는 면역형광 현미경을 통해 검사할 수 있습니다.이 방법은 축삭 수송에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 시냅스 및 근육 형태학과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 초기에는 허용 가능한 해부를 수행하는 것, 특히 뇌 분절 신경과 근육을 손상 없이 유지하는 것에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 1배 농도의 해부 버퍼 고정액, 1배 농도의 PBT 및 5% BSA 용액을 준비하십시오.해부 전 제시된 표에 상세히 설명된 대로, 해부를 시작하기 위해 깨끗한 5번 핀셋 한 쌍, 깨끗한 직선형 가위 한 쌍 및 핀을 준비하십시오. 마이크로 스푼을 사용하여 특정 유전형을 가진 3령 애벌레를 페트리 접시에 수집하십시오. 그런 다음, 탈이온수로 채워진 페트리 접시에서 애벌레를 헹구어 모든 먹이를 제거하십시오.다음으로 larva를 등면이 위로 오도록 S 가드 디쉬 위에 놓습니다. larva의 앞끝과 뒷끝을 핀으로 고정합니다. 고정된 larva 위에 미세 가위를 사용하여 일회용 해부 버퍼 한 방울을 떨어뜨립니다.후단 근처의 등쪽 정중선에서 cuticle을 살짝 집으십시오. 가위를 사용하여 후단부터 전단까지 cuticle을 절개하십시오. 절개된 부위에 new one times dissection buffer 한 방울을 떨어뜨리십시오.핀을 사용하여 유충 중앙 부근 큐티클의 한쪽 측면 가장자리를 잡고, 다른 핀을 사용하여 큐티클을 고정합니다. 큐티클의 반대쪽 측면 가장자리에도 핀을 꽂아, 도식에 표시된 것처럼 양측면에 각각 두 개의 핀이 사용되도록 합니다. 이제 장과 지방체, 기문을 조심스럽게 제거하여 두 개의 시엽과 복신경절이 포함된 뇌만 남깁니다.분절 신경을 부착시킨 후, 가드 디쉬에 유충을 부착한 상태에서 고정 및 항체 염색을 수행합니다. 해부된 유충을 50 µ

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Neuroscience

신경과학

우리는 개최 준비하는 절차를...

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

이 프로토콜은의 라이브 절개를...

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

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의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

이 동영상은 생합성과 엑디스테로이드 및 기타 호르몬 분비에 중요한 복잡한 내분비 구조인 초파리 고리샘에 대해 설명합니다. 주요 프로토콜은 해부, 고정 및 면역 염색을 보여줍니다.

유충 고리 분비선 박리: 초파리에서 발달 내분비 기관의 분리

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

중추 신경계 재생 및 수리를 조사 Drosophila 애벌레의 복부 신경 코드를 사용하여 부상 패러다임이 설명되어 있습니다. 의도적으로 개발 한 소프트웨어 및 유전학과 정량 분석​​과 함께 시간 경과 및 고정 표본에서 공 촛점 현미경을 스캔 레이저, 다음 찌른 곳은 CNS 재생 및 수리의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다.

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

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과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em&gt; 노랑 초파리</em

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배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

여기에서 우리는 생리학적 조건에서 세포 및 세포 내 역학을 관찰하기 위해 Drosophila melanogaster 세 번째 instar 유충에서 살아있는 외식편 뇌를 준비, 해부, 장착 및 이미지화하는 워크플로에 대해 논의합니다.

Drosophila melanogaster Third Instar 애벌레 뇌의 생세포 이미징

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3 애벌레 Segmental 신경의 시각화^차 Instar Drosophila 애벌레 준비

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