3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 ^차 Instar Drosophila 애벌레 준비

축삭 수송은 유충 분절 신경을 시각화하여 연구할 수 있습니다. 세 번째 instar 초파리. 유충은 먼저 절개되어 시신경, 복부 신경절 및 분절 신경을 손상시키지 않고 CNS를 노출시킵니다.

절차의 두 번째 단계는 용암을 포름알데히드로 고정시킨 후 하룻밤 동안 1차 항체로 배양하고 2차 항체를 어둠 속에서 한 시간 동안 배양하는 것입니다. 그런 다음 용암은 유리 슬라이드에 장착되고 축삭 수송 결함이 있습니다. 단백질 국소화 및 단백질 분포는 면역형광 현미경 검사를 통해 검사할 수 있습니다.

이 방법은 축삭 수송에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 시냅스 및 근육 형태와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 처음에는 특히 뇌 분절 신경과 근육을 그대로 유지하기 위해 이 허용 가능한 해부를 수행하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 절차를 시작하려면 해부 완충액 고정제 1회, PBT 1회 및 5% BSA 용액을 준비합니다.

해부 전에 표시된 표에 자세히 설명되어 있듯이 깨끗한 5번 이두근, 깨끗한 직선 블레이드 팬 가위 및 핀을 모아 해부를 시작하고 마이크로 스푼을 사용하여 방황을 수집합니다. 세 번째는 페트리 접시에 특정 유전자형을 가진 별 유충입니다. 그런 다음 탈이온수를 채운 페트리 접시에 유충을 헹궈서 모든 음식을 제거하여 유충을 씻습니다.

다음으로 등쪽이 위로 향하게 하여 S 가드 디쉬에 용암을 놓습니다. 용암을 앞쪽과 뒤쪽에 고정하십시오. 끝은 미세한 가위를 사용하여 고정된 용암 위에 일회성 해부 완충액을 한 방울 떨어뜨립니다.

뒤쪽 끝 근처의 등쪽 정중선에 있는 용암을 잘라냅니다. 가위를 사용하여 용암 표피를 뒤쪽 끝에서 앞쪽 끝까지 자릅니다. 해부된 용암에 새로운 해부 완충액 한 방울을 떨어뜨립니다.

핀을 사용하여 용암 중앙 근처에 있는 큐티클의 한쪽 측면 가장자리를 선택하고 다른 핀을 사용하여 큐티클을 고정합니다. 핀. 큐티클의 두 번째 측면 가장자리, 다이어그램과 같이 각 측면에 두 개의 핀이 사용됩니다. 이제 장과 지방체와 기관을 조심스럽게 제거하고 두 개의 시신경과 복신경절이 있는 뇌만 남깁니다.

분절 신경이 부착된 상태에서 고정 및 항체 염색은 다음으로 보호 접시에 부착된 유충으로 수행됩니다. 절개된 유충을 50마이크로리터의 고정액에 30분 동안 배양합니다. 고정 후 15 분마다 정착제를 교체하고 30 분 동안 PBT로 1 회 유충을 헹굽니다.

10분마다 완충액을 교체함으로써 유충은 항상 완충액에 잠겨야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 1차 항체 용액을 5%BSA 용액에 적절한 농도로 희석하여 준비합니다. 최적 농도는 항체에 따라 다릅니다.

Kim과 함께 플라스틱 접시를 깔아 습한 방을 만드십시오. 물에 적신 물티슈. 마지막 PBT를 교체합니다.

준비된 1차 항체 용액으로 헹구고 다음날 섭씨 4도의 습한 챔버에서 하룻밤 동안 배양합니다. 절개된 유충을 10분마다 완충액을 교체하여 30분 동안 PBT로 1회 헹굽니다. 2차 항체를 5%BSA 용액에 적절한 농도로 희석하여 준비합니다.

그리고 일부 2차 항체는 빛에 민감하므로 습한 챔버를 호일로 감쌉니다. 유충을 섭씨 25도에서 2차 항체 용액으로 한 시간 동안 배양합니다. 2차 항체를 이용한 배양이 완료되면 10분마다 완충액을 교체하여 30분 동안 PBT로 1회 헹구고 슬라이드에 용암을 장착하기 전에 절개된 유충을 장착하고 시각화합니다.

그림과 같이 커버 슬립이 앉을 수 있을 만큼 큰 공간을 두고 중간에 매니큐어를 세로로 두 개 펴서 슬라이드를 준비합니다. 매니큐어가 마르면 매니큐어를 완전히 말리십시오. 이 이미지와 같이 슬라이드의 수직 매니큐어 선 사이의 공간에 장착 버퍼 한 방울을 놓습니다.

이제 슬라이드를 장착할 준비가 되었습니다. PBT를 마지막으로 한 번 수행한 후 유충을 회수합니다. 용암에서 측면 핀을 헹구고 부드럽게 제거합니다.

큐티클이 조심스럽게 찢어지지 않도록 주의하세요. 나머지 두 개의 핀을 제거하고 집게로 용암을 집어 준비된 슬라이드에 놓습니다. 용암이 뒤집히지 않고 복부 방향인지 확인하십시오.

측면이 위로 향하게 하여 커버 슬립을 위에 부드럽게 놓고 여기 그림과 같이 매니큐어로 가장자리를 밀봉합니다. 이제 유충은 형광 현미경으로 시각화할 준비가 되었습니다. 이 대표적인 이미지는 시냅스 소포 단백질인 시스틴 끈 단백질에 대한 항체로 염색된 야생형 용암입니다.

용암 분절 신경은 매끄럽게 염색되어 있습니다. 여기. 운동 단백질 돌연변이 용암은 CSP에 대한 항체로 염색되었습니다. 분절 신경은 CSP에 대해 밝게 얼룩지는 엄청난 축적을 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안 뇌에 연결된 분절 신경을 유지하고 근육을 그대로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 해부 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 세 번째로 면역염색제를 수정하고 유충 분절 신경을 시작하여 형광 현미경을 사용하여 축삭 수송을 연구합니다.