3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 ^차 Instar Drosophila 애벌레 준비

유충의 분절 신경을 시각화함으로써 축삭 수송을 연구할 수 있습니다. 3령 초파리 유충을 사용합니다. 먼저 유충을 해부하여 시각엽, 복측 신경절 및 분절 신경을 손상시키지 않고 중추신경계(CNS)를 노출시킵니다.

절차의 두 번째 단계는 포름알데히드(formaldehyde)로 라바(lava)를 고정하는 것이며, 이후 1차 항체와 함께 하룻밤 동안, 그리고 2차 항체와 함께 암실에서 한 시간 동안 배양합니다. 그 다음 라바를 유리 슬라이드에 마운트하여 축삭 수송 결함을 확인합니다. 면역형광 현미경을 통해 단백질 국소화 및 단백질 분포를 검토할 수 있습니다.

이 방법은 축삭 수송에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라 시냅스 및 근육 형태학 등 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 초기 단계에서 허용 가능한 해부를 수행하는 것, 특히 뇌 분절 신경과 근육을 온전하게 유지하는 것에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 1배액 해부 완충 고정액, 1배액 PBT 및 5% BSA 용액을 준비하십시오.

해부 전 제시된 표에 상세히 나와 있듯이, 해부를 시작하기 위해 깨끗한 5번 핀셋 한 쌍, 깨끗한 직선형 가위 한 쌍 및 핀을 준비하십시오. 마이크로 스푼을 사용하여 특정 유전형을 가진 3령 애벌레를 페트리 접시에 수집하십시오. 그런 다음, 탈이온수로 채운 페트리 접시에서 애벌레를 헹구어 모든 먹이를 제거하십시오.

다음으로 유충을 등면이 위로 향하게 하여 S 가드 디쉬 위에 놓습니다. 유충의 앞끝과 뒤끝을 핀으로 고정합니다. 미세 가위를 사용하여 고정된 유충 위에 1회용 해부 완충액 한 방울을 떨어뜨립니다.

후단 근처의 등쪽 중앙선에서 유충의 껍질을 살짝 집으십시오. 가위를 사용하여 유충의 큐티클을 후단에서 전단까지 절개하십시오. 절개된 유충 위에 1배 농도의 해부 완충액 한 방울을 떨어뜨리십시오.

핀을 사용하여 유충 중앙 부근 큐티클의 한쪽 측면 가장자리를 집어 올린 후, 다른 핀으로 큐티클을 고정합니다. 큐티클의 반대쪽 측면 가장자리까지, 도식에 표시된 대로 각 측면에 두 개의 핀을 사용합니다. 이제 장과 지방체, 기문을 조심스럽게 제거하여 두 개의 시엽과 복부 신경절이 포함된 뇌만 남깁니다.

분절 신경이 부착된 상태에서, 유충을 가드 디쉬에 고정시킨 후 고정과 항체 염색을 차례로 수행합니다. 해부된 유충을 50 µL의 고정액에서 30분 동안 배양합니다. 고정 후 15분마다 고정액을 교체하며, 이후 1× PBT로 유충을 30분 동안 세척합니다.

10분마다 버퍼를 교체하되, 유충이 항상 버퍼에 잠겨 있어야 한다는 점에 유의하십시오. 5% BSA 용액으로 1차 항체를 적절한 농도로 희석하여 항체 용액을 준비합니다. 최적 농도는 항체마다 다릅니다.

플라스틱 접시에 물에 적신 Kimwipe를 깔아 습윤 챔버를 구축합니다. 마지막 단계에서 PBT를 1회 교체합니다.

준비된 1차 항체 용액으로 헹군 후 습윤 챔버에서 4°C로 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 10분마다 버퍼를 교체하며 1배 PBT로 해부된 유충을 30분 동안 헹굽니다. 5%BSA 용액에 2차 항체를 적절한 농도로 희석하여 준비합니다.

일부 2차 항체는 빛에 민감하므로 습윤 챔버를 호일로 감싸십시오. 25 °C에서 1시간 동안 유충을 2차 항체 용액과 함께 배양합니다. 2차 항체 배양이 끝나면, 10분마다 버퍼를 교체하며 30분 동안 1배 PBT로 유충을 세척하고, 슬라이드에 고정하기 전에 해부된 유충을 마운팅 및 시각화하는 단계로 진행하십시오.

다이어그램에 표시된 것처럼 커버 슬립이 놓일 수 있을 만큼 충분한 간격을 두고 슬라이드 중앙에 네일 폴리쉬를 이용해 두 개의 수직선을 그려 슬라이드를 준비합니다. 네일 폴리쉬가 완전히 마를 때까지 기다립니다. 이 이미지에 표시된 것처럼 슬라이드의 수직 네일 폴리쉬 선 사이의 공간에 마운팅 버퍼 한 방울을 떨어뜨립니다.

이제 슬라이드 마운트를 준비합니다. 마지막 PBT 처리 시간이 지난 후 유충을 회수합니다. 세척 후 유충에서 측면 핀을 조심스럽게 제거합니다.

큐티클이 찢어지지 않도록 주의하십시오. 남아 있는 핀 두 개를 제거하고 포셉으로 유충을 집어 준비된 슬라이드 글라스 위에 올립니다. 유충이 뒤집히지 않았는지 확인하고 복측이 위를 향하도록 배치하십시오.

커버 슬립을 조심스럽게 위에 덮고, 여기 그림과 같이 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 이제 유충을 형광 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다. 이 대표 이미지는 시냅스 소포 단백질인 cystine string protein에 대한 항체로 염색한 야생형 유충의 모습입니다.

lava 분절 신경이 매끄럽게 염색되었습니다. 여기는 CSP에 대한 항체로 염색한 운동 단백질 돌연변이 lava입니다. 분절 신경에서 CSP가 밝게 염색되는 거대한 축적물이 관찰됩니다.

이 절차를 수행할 때는 뇌에 연결된 분절 신경을 유지하고 근육을 손상시키지 않는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하신 후에는 해부 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 형광 현미경을 사용하여 축삭 수송을 연구하기 위해, 면역 염색된 세 번째 유충 분절 신경을 고정하십시오.