Name: 3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 3령 애벌레의 축삭 수송 메커니즘을 면역형광 현미경으로 연구하는 방법을. 돌연변이와 야생형 비교를 통해 신경계 발달 및 단백질 국소화를 분석할 수 있습니다.

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SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다.

1. 시약의 준비 <ol><li> 128 MM NaCl, CaCl 4mm짜리 2, 4mm짜리 MgCl 2, 2 KCl MM, 5mM HEPES 및 36mM 자당를 사용하여 절개 1X 버퍼를 준비합니다. PH 7.2 솔루션 및 필터 소독. </li><li> 16 % 포름 알데히드 및​​ 1X 해부 버퍼의 1시 1분 희석을 사용하여 정착액을 준비합니다. </li><li> 1X 인산을 사용하여 1X PBT 준비 살린 (PBS)는 1:100 비율 7.2 그리고 Triton X - 100의 PH에 버퍼. </li><li> 준비 5% 소 혈청 0.01 %가 1X PBS에서 Azide 나와 함께 (BSA) 알부민. </li></ol> 2. 해부를위한 준비 <ol><li> Sylgard 요리는 절개에 사용됩니다. Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 기지를 따르고하고 페트리 접시에 에이전트 혼합물을 치료하여 요리를 준비합니다. 혼합물이 완전히 사용하기 전에 응고 및 건조 수 있습니다. </li><li> 절개 전에 깨끗한 # 5 포셉의 쌍, 직선 블레이드 vannas 가위의 클린 쌍, 그리고 핀을를 수집합니다. </li></ol> 3. 제 3 Instar의 애벌레의 해부 <ol><li> 배양 접시에 특정 유전자형 3 차 instar의 애벌레를 헤매고 수집합니다. </li><li> 음식 없애 탈이온수에서 애벌레를 씻으십시오. </li><li> 등의 측면까지 함께 sylgard 요리에 유충 놓으십시오. 그 앞쪽에 및 사후 끝에 유충을 핀. </li><li> 고정된 유충에 1X 해부 버퍼의 드롭 놓습니다. 고급 가위 따다에게 사후 끝 근처 등의 정중선에 유충을 사용합니다. 가위를 사용하여 앞의 끝에 통해 사후 하순부터 애벌레 표피를 잘라. </li><li> 해부 유충에 새로운 1X 해부 버퍼의 드롭 놓습니다. PIN을 사용하여 유충의 중간 근처 표피 중 하나 측면 가장자리를 선택하고 표피를 핀. 다른 핀 사용으로 그림과 같이 표피의 두 번째 측면 가장자리를 핀. 두 핀이 각 측면 측면에 사용됩니다. 아래 다이어그램을 참조하십시오. </li><li> 조심스럽게 첨부 segmental 신경 함께 두 개의 광학 엽 (叶)과 복부 신경만을 두뇌를 떠나, 창자, 지방 단체 및 기관을 제거하십시오. 절차의 나머지 부분은 sylgard 요리에 이루어집니다. </li></ol> 4. 해부 유충의 고정 <ol><li> 매 15 분 수정을 대체하여, 30 분 수정의 해부 유충 부화. </li><li> 고정 후, 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT의 유충을 씻어. 유충은 항상 버퍼에 있​​어야합니다하는 것이 중요합니다. </li></ol> 5. 해부 유충의 항체 스테 이닝 <ol><li> 1X PBT에서 나 Azide와 5 % BSA의 적절한 농도를 diluting하여 기본 항체를 준비합니다. 최적의 농도는 다른 항체를 위해 다를 수 있습니다. </li><li> 마지막 1X PBT은 준비된 차 항체 솔루션 린스, 4 ° C 하룻밤에 습기가 실내에 품어 바꿉니다. 습기 챔버가 물에 젖었 김 - 잎사귀와 플라스틱 접시를 안감으로 구성되어 있습니다. </li><li> 그 다음날, 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT에서 해부하는 유충을 씻어. </li><li> 1X PBT에서 나 Azide와 5 % BSA의 적절한 농도를 diluting하여 이차 항체를 준비하고, 한 시간 동안 25 ° C에서 차 항체 솔루션 유충 부화. 이차 항체가 민감한 빛 있으므로, 빛을 방지하기 위해 호일에 습한 챔버를 바꿈. </li><li> 부화 후 10 분 간격으로 버퍼를 교체하여 30 분 1X PBT의 유충을 씻어. </li></ol> 6. 장착 및 해부 유충의 시각화 <ol><li> 슬라이드에있는 유충을 설치하기 전에 (그림 참조)에 앉을 수있는 커버 슬립을위한 충분한 공간, 중간에 매니큐어 두 수직선을 확산하여 슬라이드를 준비합니다. 완전히 손톱 폴란드 건조하자. </li><li> 슬라이드에서 세로 매니큐어 라인 (그림 참조) 사이의 공간에 장착 버퍼의 한 방울을 넣으십시오. 슬라이드 이제 설치 준비가되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.1.jpg" alt="그림 1 단계 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1 단계 6.2"> <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.2.2.jpg" alt="그림 2 단계 6.2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2 단계 6.2"></li><li> 마지막 1X PBT는 린스 후, 부드럽게 측면 핀을 제거합니다. 표피 찢어하지 않도록주의한다. </li><li> 조심스럽게 두 남은 핀을 제거하고 집게로 유충을 선택하고 준비 슬라이드 수평 유충을 놓으십시오. 유충이 이상의 이성을 상실하고 지향 복부 측면가 없습니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 부드럽게 위에 커버 용지를 놓고 (그림 참조) 매니큐어와 가장자리를 밀봉. 유충 지금은 형광 현미경으로 시각화를위한 준비가되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2128/2128.6.5.jpg" alt="그림 1 단계 6.5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1 단계 6.5"></li></ol> 7. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 : 야생 유형 larv에서 애벌레 segmental 신경의 대표 이미지(CSP, Zinsmaier 외. 1994) 시냅스 소포 단백질 시스테인 문자열 단백질에 대한 항체를 사용하여. segmental 신경이 원활하게 스테인드됩니다. 바 = 20μm <img src="/files/ftp_upload/2128/2128fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 시냅스 소포 단백질 시스테인 문자열 단백질 (CSP)에 대한 항체를 사용하여 모터 단백질 돌연변이 유충에서 애벌레 segmental 신경의 대표 이미지. segmental 신경이 CSP (화살표)에 대한 밝은 얼룩 거대한 축적을 표시합니다.

<ol><li>Gunawardena, S., Goldstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Axonal+Transport+and+Neuronal+Viability+by+Amyoid+Precursor+Protein+Mutations+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila.</a> Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).</li>
<li>Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralysis+and+early+death+in+cysteine+string+protein+mutants+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila.</a> Science. 263, 977-980 (1994).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Drosophila 애벌레 segmental 신경 axonal 교통 메커니즘을 연구하기위한 강력한 시스템입니다. 3 차 instar 애벌레의 절개가 올바르게 수행하는 경우, 등 근육과 NMJs 같은 CNS, PNS, 및 관련 조직, 모든 구성 요소는 하나의 유충 이내에 검사를하실 수 있습니다. 우리는 허드와 색스턴 (1996)에 의해 출판 하나에서이 프로토콜을 적응있다. 이 프로토콜은 다른 항체의 연결을 테스트하는 적응 될 수 있지만, 항체의 최적화 할 수 있습니다. 기본 및 보조 항체 보육 시간은 변경될 수 있습니다 또는 차단 단계는 추가할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 아밀로이드 전구체 단백질 1과 axonal 교통 Huntingtin 2의 역할을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Minutien 핀, 스테인리스강</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Mcpherson-Vannas 직선형 블레이드 8cm 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>50822236</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 마운팅 매질</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머</td><td>Dow Corning</td><td>4026148</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>dCSP3</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr></tbody></table>

3 애벌레 segmental 신경의 시각화 차 instar drosophila 애벌레 준비

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster 특히 때문에 편리 유전 완전 합성 게놈의 신경 계통의 발달과 기능을 연구를위한 강력한 모델 시스템으로 대두되고 있습니다. 또한, 애벌레 신경 시스템은 애벌레 segmental 신경이 신체의 길이를 따라 결말 두뇌 및 신경 터미널 내에있는 자신의 세포 기관과 axons의 번들을 포함하는 등 axonal 교통의 메커니즘을 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 여기 애벌레 segmental 신경 사이 시냅스 소포 단백질의 시각화를위한 절차를 설명합니다. 제대로하면, 신경 시스템의 모든 구성 요소는 이러한 근육과 NMJs 등 관련 조직과 함께, 손상 손상 및 시각 준비가 남아있다. 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레가 해부되고, 고정 시냅스 소포 항체와 incubated, 시각 및 야생 입력 유충에 비해. 이 절차는 쉽게 애벌레 segmental 신경 내에서 볼 수 있습니다 단백질의 다양한 배포판에 여러 다른 시냅스의 연결 또는 항체 및 변경 적용할 수 있습니다.

Drosophila melanogaster의 애벌레가 애벌레 segmental 신경 이내 axonal 수송의 메커니즘을 조사하기 위해 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 이 절차를 사용하여 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레는 야생 타입 애벌레 비교할 수 있습니다.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

*Drosophila melanogaster*는 특히 ... 덕분에 신경계의 발달과 기능을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템으로 부상하고 있습니다.

유충의 마디 신경을 시각화함으로써 축삭 수송을 연구할 수 있습니다. 3령 초파리 유충의 사례입니다. 먼저 유충을 해부하여 시각 엽, 복측 신경절 및 마디 신경을 손상시키지 않고 중추신경계(CNS)를 노출시킵니다.절차의 두 번째 단계는 포름알데히드(formaldehyde)로 라바(lava)를 고정한 후, 1차 항체와 함께 하룻밤 동안, 그리고 2차 항체와 함께 암실에서 1시간 동안 배양하는 것입니다. 그 다음 라바를 유리 슬라이드에 마운트하여 축삭 수송 결함을 확인합니다. 단백질 국소화 및 단백질 분포는 면역형광 현미경을 통해 검사할 수 있습니다.이 방법은 축삭 수송에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 시냅스 및 근육 형태학과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 초기에는 허용 가능한 해부를 수행하는 것, 특히 뇌 분절 신경과 근육을 손상 없이 유지하는 것에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 1배 농도의 해부 버퍼 고정액, 1배 농도의 PBT 및 5% BSA 용액을 준비하십시오.해부 전 제시된 표에 상세히 설명된 대로, 해부를 시작하기 위해 깨끗한 5번 핀셋 한 쌍, 깨끗한 직선형 가위 한 쌍 및 핀을 준비하십시오. 마이크로 스푼을 사용하여 특정 유전형을 가진 3령 애벌레를 페트리 접시에 수집하십시오. 그런 다음, 탈이온수로 채워진 페트리 접시에서 애벌레를 헹구어 모든 먹이를 제거하십시오.다음으로 larva를 등면이 위로 오도록 S 가드 디쉬 위에 놓습니다. larva의 앞끝과 뒷끝을 핀으로 고정합니다. 고정된 larva 위에 미세 가위를 사용하여 일회용 해부 버퍼 한 방울을 떨어뜨립니다.후단 근처의 등쪽 정중선에서 cuticle을 살짝 집으십시오. 가위를 사용하여 후단부터 전단까지 cuticle을 절개하십시오. 절개된 부위에 new one times dissection buffer 한 방울을 떨어뜨리십시오.핀을 사용하여 유충 중앙 부근 큐티클의 한쪽 측면 가장자리를 잡고, 다른 핀을 사용하여 큐티클을 고정합니다. 큐티클의 반대쪽 측면 가장자리에도 핀을 꽂아, 도식에 표시된 것처럼 양측면에 각각 두 개의 핀이 사용되도록 합니다. 이제 장과 지방체, 기문을 조심스럽게 제거하여 두 개의 시엽과 복신경절이 포함된 뇌만 남깁니다.분절 신경을 부착시킨 후, 가드 디쉬에 유충을 부착한 상태에서 고정 및 항체 염색을 수행합니다. 해부된 유충을 50 µL의 고정액에 넣고 30분 동안 배양합니다. 15분마다 고정액을 교체해 줍니다. 고정이 끝나면 1x PBT에서 유충을 30분 동안 세척합니다.10분마다 완충액을 교체할 때, 유충이 항상 완충액에 잠겨 있어야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 5% BSA 용액으로 적절한 농도까지 희석하여 1차 항체 용액을 준비하십시오. 최적 농도는 항체마다 다릅니다.플라스틱 접시에 물에 적신 Kimwipe를 깔아 습윤 챔버를 제작합니다. PBT를 마지막으로 교체합니다.준비된 1차 항체 용액으로 헹군 다음, 가습 챔버에서 4°C로 다음 날까지 하룻밤 동안 배양합니다. 해부된 유충을 1x PBT로 30분 동안 헹구되, 10분마다 버퍼를 교체해 줍니다. 5% BSA 용액으로 2차 항체를 적절한 농도로 희석하여 준비합니다.일부 2차 항체는 빛에 민감하므로 습윤 챔버를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 유충을 25 °C의 2차 항체 용액에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 배양이 완료되면, 10분마다 버퍼를 교체하며 1배 PBT로 30분 동안 유충을 세척하고, 슬라이드에 고정하기 전에 해부한 유충을 마운팅하고 시각화하는 과정을 진행합니다.다이어그램에 표시된 것과 같이 커버 슬립이 놓일 수 있을 정도의 충분한 간격을 두고 슬라이드 중앙에 매니큐어를 사용하여 두 개의 수직선을 그어 슬라이드를 준비합니다. 매니큐어가 완전히 마를 때까지 기다립니다. 이 이미지에 표시된 것과 같이 슬라이드 위의 수직 매니큐어 선 사이의 공간에 마운팅 버퍼 한 방울을 떨어뜨립니다.이제 슬라이드를 마운트할 준비가 되었습니다. 마지막 PBT 처리 시간이 지난 후 유충을 회수하십시오. 헹군 뒤 유충에서 측면 핀을 조심스럽게 제거하십시오.큐티클이 찢어지지 않도록 주의하십시오. 남은 핀 두 개를 제거하고 핀셋으로 유충을 집어 준비된 슬라이드 위에 올립니다. 유충이 뒤집히지 않고 복측이 아래로 향하도록 배치하십시오.커버 슬립을 조심스럽게 위에 덮고, 여기 그림과 같이 가장자리를 매니큐어로 밀봉합니다. 이제 유충을 형광 현미경으로 관찰할 준비가 되었습니다. 이 대표 이미지는 시냅스 소포 단백질인 cystine string protein에 대한 항체로 염색한 야생형 유충의 모습입니다.lava 분절 신경이 매끄럽게 염색되었습니다. 여기서는, 운동 단백질 돌연변이체인 lava를 CSP 항체로 염색하였습니다. 분절 신경에서 CSP가 밝게 염색되는 거대한 축적물이 관찰됩니다.이 절차를 수행할 때, 뇌에 연결된 분절 신경을 유지하고 근육을 온전하게 보존하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 해부 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 형광 현미경을 이용하여 축삭 수송을 연구하기 위해 면역 염색된 3일 차 유충 분절 신경을 고정하십시오.

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연구

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Neuroscience

신경과학

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전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

이 프로토콜은의 라이브 절개를...

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유충 고리 분비선 박리: 초파리에서 발달 내분비 기관의 분리

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

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3 애벌레 Segmental 신경의 시각화^차 Instar Drosophila 애벌레 준비

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